SlSP5G3基因對‘Micro-Tom’番茄開花和產量的影響

許達為，曹 凱,2，鄒佳寧，王昊天，鄒志榮

(1.西北農林科技大學 園藝學院，農業部西北設施園藝工程重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.江蘇省農業科學院，農業部長江中下游設施農業工程重點實驗室，南京 210014)

開花是植物從營養生長到生殖生長過渡的重要階段。在被子植物和裸子植物中均發現磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)，它們是一類既能促進開花又能抑制開花的因子，可以分為3個亞家族，分別為FT-like亞家族、TFL1-like亞家族和MFT-like亞家族[1-2]。

FT-like亞家族作為PEBP家族中的重要成員，在控制開花時間、花序發育和產量方面產生重要影響。FT-like蛋白促進植物開花已經在多個物種中得到證實，如楊樹(Populusspp)[3]、蘋果(Malusdomestica)[4]、甜菜(Betavulgaris)[5]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[6]、煙草(Nicotianatabacum)[7]和水稻(Oryzasativa)[8]。雖然幾乎所有FT-like蛋白都作為開花促進因子起作用，但在甜菜和煙草中，有的促進開花，有的抑制開花。甜菜中BvFT1蛋白在開花中起抑制作用，BvFT2蛋白起促進作用[5]。在煙草的4個FT-like蛋白中，NtFT1、NtFT2和 NtFT3蛋白抑制開花，NtFT4蛋白促進開花[7]。FT-like蛋白還會影響花的發育，番茄SFT基因是擬南芥FT的同源基因，番茄sft突變體只有1～2朵花，且花萼葉片化。番茄中過表達SFT基因，番茄合軸分枝的葉片數從3片降低到2片[9-10]。FT-like蛋白通過參與源庫調控改變果實性狀和產量指標，在大豆(GlycinemaxL.)中，開花促進因子GmFT和開花抑制因子GmTFL1的相對含量協調了營養生長與生殖生長的關系，從而調控了開花時間和開花后莢果的發育[11-13]。番茄成熟葉片中SFT基因合成的成花素物質，可以通過篩管細胞轉運到庫器官尤其幼葉中，影響庫器官的形成[14]。

目前，在番茄中已鑒定出4個表達的FT-like蛋白分別為SFT、SlSP5G、SlSP5G2和SlSP5G3[15]。其中SlSP5G3蛋白在番茄中與開花和果實產量相關的功能未知，為明確其生物學功能，本試驗分析了SlSP5G3在番茄‘Micro-Tom’中的表達規律，并通過轉基因分析初步發現SlSP5G3在調控番茄開花和產量方面發揮了重要作用，為揭示FT-like蛋白在調節植物生長發育過程中的作用機制提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試材樣品的獲得

試驗材料為矮生番茄(SolanumlycopersicumL.)‘Micro-Tom’和SlSP5G3基因過表達株系。試驗材料在西北農林科技大學農業部設施工程重點實驗室人工氣候箱(RDN-1000D-4，寧波東南儀器有限公司)中培養，栽培環境設定為：光照時長12 h，光照強度100 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度25 ℃/18 ℃，相對濕度60%～70%。取野生型幼苗的根、莖、莖尖、花、子葉和真葉，用液氮速凍保存，用于RNA的提取。

1.2 植株總RNA 的提取及 SlSP5G3基因的表達水平分析

采用RNA試劑盒(Omega公司，中國廣州)提取番茄組織總RNA，采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司，中國大連)完成反轉錄cDNA的合成。

qRT-PCR采用SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara公司，中國大連)，qRT-PCR的反應程序為：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s，共40個循環；融解曲線95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，冷卻40 ℃ 1 s，可以適當地增加循環數，獲得融解曲線數據，以番茄Actin基因作為內參[16]，重復3次，然后采用公式計算基因的相對表達量。引物(表1)的合成及目的基因測序均由奧科鼎盛生物科技公司(中國楊凌)完成。

1.3 質粒的構建和遺傳轉化

在番茄基因組數據庫(https://solgenomics.net)里找到SlSP5G3(Solyc11g008650)的CDS序列，利用Vector NTI設計引物SlSP5G3-F1、SlSP5G3-R1通過PCR擴增，兩端分別加入同源重組序列(圖1)，以番茄嫩葉的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR的反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收目的條帶。利用同源重組的方法連接到過表達載體pHellsgate8(澤葉生物科技有限公司，中國上海)中進行測序，測序正確的質粒用于轉化農桿菌。

將野生型番茄‘Micro-Tom’種子置于超凈工作臺上，清水浸泡10 min，用體積分數為75%酒精清洗種子30 s，體積分數為2%次氯酸鈉溶液震蕩15 min，滅菌水清洗種子2～3次。清洗過的種子接種到培養基中，移入西北農林科技大學園藝學院組織培養室，培養條件為光照時間12 h，晝夜溫度為25 ℃/18 ℃，培養7～9 d至2片子葉完全展平后進行目的基因的轉化。參照葉志彪等[17]建立的番茄轉化體系并略有改動，經過侵染、篩選培養和繼代培養、生根培養等過程獲得卡那霉素抗性植株。結合抗生素篩選、PCR和實時熒光定量PCR檢測陽性苗目的基因表達水平，鑒定過表達植株。

1.4 轉基因植株開花時間和上游基因的測定

選取野生型番茄‘Micro-Tom’(WT)和過表達株系(L8、L12)移入光照培養箱培養(培養條件同上)，開花后隨機選取3株作為一組記錄開花所需的葉片數，取平均值。在番茄基因組數據庫(https://solgenomics.net)里找到編碼FT-like基因上游轉錄因子基因SlSPCDF1(Solyc03g115940)、SlSPCDF2(Solyc05g007880)、SlSPCDF3(Solyc06g 069760)、SlSPCDF4(Solyc06g069760)、SlSPCDF5(Solyc02g088070)、TCOL1(Solyc02g089540)、TCOL2(Solyc02g895000)和TCOL3(Solyc02g089520)[18-19]的CDS序列，利用Vector NTI設計實時熒光定量PCR引物(表1)，操作方法同上。

1.5 轉基因植株地上部干鮮質量及產量的測定

在野生型番茄‘Micro-Tom’(WT)和T2代過表達株系(L8、L12)中隨機選取5株植株掛牌標記，每株留3穗果打頂。試驗結束后將植株地上部分按莖葉分開，采用萬分之一天平稱量其鮮質量。然后將稱量后的莖葉放在烘箱中80 ℃下72 h烘至恒量，采用萬分之一天平稱量莖葉干質量。果實成熟后，統計每株番茄的果實數量及單果質量，計算單株產量。

1.6 數據處理與分析

用SPSS 20.0數據處理軟件對試驗數據進行方差分析及顯著性檢驗，用Excel 2010進行數據分析及圖表制作。

表1 構建過表達載體、實時熒光定量PCR和陽性苗檢驗引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study for plasmid construction,real-time fluorescent quantitative PCR and positive seedling check

圖1 植物超表達載體Phellsgate8示意圖Fig.1 Schematic representation of Phellsgate8 regions of 35S∷ SlSP5G3

2 結果與分析

2.1 ‘Micro-Tom’過表達株系中 SlSP5G3的表達量檢測

通過根癌農桿菌介導法，將含SlSP5G3基因的過表達載體導入番茄中。CTAB法提取獲得的8株再生植株的基因組DNA，通過陽性苗檢驗引物SlSP5G3-F3、SlSP5G3-R3進行PCR擴增，以不含目的基因的空質粒(pHellsgate8)作為陽性對照，野生型番茄‘Micro-Tom’植株基因組DNA(WT)為陰性對照，結果顯示共有4株擴增出長度為222 bp的條帶，與目的條帶大小一致，即獲得4株轉基因陽性苗，分別為L3、L8、L12、L14(圖2-A)。

進一步確定目的基因的表達水平，通過實時熒光定量PCR分析野生型番茄‘Micro-Tom’和過表達株系L3、L8、L12、L14中SlSP5G3的表達量情況，發現L8和L12的表達量明顯高于野生型植株，分別增加了4.625倍和4倍，進而選取L8和L12移入人工氣候箱(栽培環境同上)培育T2代轉基因植株進行后續的開花產量指標測定。

2.2 SlSP5G3基因的表達規律

在野生型‘Micro-Tom’番茄提取cDNA中利用引物SlSP5G3-F和SlSP5G3-R，進行目的基因SlSP5G3的實時熒光定量PCR檢測。在日中性條件下，SlSP5G3的表達量隨光照時間變化，在開始光照時上升，在4 h時達到最大，在進入黑暗后4 h達到最低(圖3-A)，推測SlSP5G3可以感受外界光信號。不同葉齡中SlSP5G3的表達量無明顯變化趨勢，說明其不受生長發育周期的影響(圖3-B)。在番茄植株中，真葉和子葉SlSP5G3表達量最高，莖、莖尖、花和根中基本不表達，說明SlSP5G3的表達具有組織特異性(圖3-C)。

A.普通PCR檢測轉基因植株陽性苗 Detection of positive seedling in stransgenic plant by ordinary PCR；B.實時熒光定量PCR檢測SlSP5G3轉基因株系表達量 Detection of the expression level ofSlSP5G3in transgenic line by qRT-PCR

圖2轉基因幼苗的PCR檢測
Fig.2PCRfordetectionoftransgenicseedlings

A.SlSP5G3的表達量日變化 The variation of the expression level ofSlSP5G3throughout the day；B.植株由上至下8片葉SlSP5G3的表達量變化 The variation of expression ofSlSP5G3from the top 8 leaves of plants；C.不同器官SlSP5G3的表達量變化 The variation of expression ofSlSP5G3in different tissues

圖3SlSP5G3表達量變化規律
Fig.3ThevariationofexpressionofSlSP5G3

2.3 SlSP5G3對開花時間的影響

番茄生長發育中每增長一片葉的時間受環境因素影響較小約為4～6 d，故番茄的開花時間可以由開花前所需葉片數來衡量[20]。將T2代轉基因株系(L8、L12)和野生型番茄‘Micro-Tom’(WT)催芽后定植于人工氣候箱，栽培環境同上，記錄開花所需的葉片數。發現L8和L12開花時間明顯晚于WT(圖4-A，圖4-B)。數據分析L8、L12和WT開花所需葉片數顯示，與野生型番茄WT相比，L8和L12開花所需葉片數明顯增加，分別為2.34和2.67片。

2.4 SlSP5G3對上游開花相關基因TCOLs和SlCDFs的影響

通過實時熒光定量PCR檢測T1代過表達株系(L8、L12)和野生型番茄‘Micro-Tom’(WT)上游TCOLs和SlCDFs的表達情況。L8、L12和WT中，SlCDF2的表達量最高，SlCDF3的表達量最低。相比于WT，過表達L8、L12明顯上調了SlCDF3的表達量，分別增加了4.50倍和9.61倍(圖5-A)；在L8、L12和WT中，TCOL1的表達量最高，TCOL3的表達量最低，但與WT相比，L8和L12并無明顯的變化趨勢。

2.5 SlSP5G3對番茄地上部生長和產量的影響

SlSP5G3基因過表達對番茄植株地上部形態及產量性狀產生了不同程度的影響(表2)。與野生型植株(WT)相比，轉基因株系L8和L12葉片鮮質量分別增加98.43%和76.89%；葉片干質量分別增加62.79%和41.86%；果實單果質量分別增加49.65%和36.13%；單株產量分別增加34.50%和26.74%，而莖的干鮮質量和單株果數無明顯差異。

圖C中a和b表示各處理間差異顯著(P<0.05) a and b mean significant difference(P<0.05) in Duncan’s in figure C

A.SlSP5G3過表達植株L8和野生型植株的開花對比圖 Flowering comparison ofSlSP5G3over-expressing strain L8 and wild type plants；B.SlSP5G3過表達植株L12和野生型植株的開花對比圖 Flowering comparison ofSlSP5G3over-expressing strain L12 and wild type plants；C.SlSP5G3過表達植株和野生型植株的開花所需葉片數 Number of leaves to flowering ofSlSP5G3over-expressing plants and wild type plants

圖4SlSP5G3過表達植株和野生型株的開花時間
Fig.4FloweringtimeofSlSP5G3over-expressingplantsandwildtypeplants

A.SlSP5G3過表達植株和野生型植株對SlCDFs表達量的影響 Effects ofSlSP5G3over-expressing plants and wild type plants on the expression ofSlCDFs；B.SlSP5G3過表達植株和野生型植株對TCOLs表達量的影響 Effects ofSlSP5G3over-expressing plants and wild type plants on the expression ofTCOLs

圖5 SlSP5G3過表達植株和野生型植株中SlCDFs和TCOLs的表達量Fig.5 The expression of SlCDFs and TCOLs in SlSP5G3 over-expressing plants and wild type plants

注：數據均以“平均值±標準差”表示，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Data in the table are presented as “mean±standard deviation”,the different lowercase letters in the same column indicates significant difference(P<0.05).

3 討 論

葉片是植物感受光周期的主要部位，光敏色素作為葉片中感受光信號的最初受體與擬南芥FT基因表達的相互作用已經被證明[21-22]。本研究發現SlSP5G3能夠感受光信號，在光照開始后4 h上升至最高，在進入黑暗后4 h下降至最低，可能是由于光敏色素傳遞了光信號，但其與SlSP5G3的作用關系還需要進一步的驗證。SlSP5G3在葉片和子葉中的表達量最高，其他組織基本不表達，且不受發育時期的影響，這與煙草FT-like基因表達一致[7]。

FT-like蛋白的功能很大程度是由其氨基酸序列決定的，曹凱[23]通過蛋白質序列比對發現，在番茄SlSP3D蛋白的3個關鍵位置的氨基酸殘基分別為酪氨酸(133)、甘氨酸(136)和色氨酸(137)與其他的開花活化因子相匹配，如擬南芥中的FT蛋白、甜菜的BvFT2蛋白和煙草的NtFT4蛋白。而番茄SlSP5G的氨基酸序列的這3個保守位點與大多數開花抑制因子是一樣的，如煙草中FT蛋白NtFT1、NtFT2、NtFT3。番茄SlSP5G2蛋白和SlSP5G3蛋白在相應位點與其他番茄FT-like蛋白相比都發生了一定改變。本試驗通過培育轉基因‘Micro-Tom’發現過表達SlSP5G3可以延遲開花，與對照相比平均晚開花 2～3 片葉，可能是由于保守位點的基因突變將其功能轉變為抑制開花。擬南芥CDF和COL蛋白是調控FT基因表達的轉錄因子，番茄存在與擬南芥CDF和COL高度同源的蛋白分別是SlCDF1、SlCDF2、SlCDF3、SlCDF4、SlCDF5、TCOL1、TCOL2和TCOL3。本試驗發現在SlSP5G3過表達植株中，3個TCOLs基因和4個SlCDFs基因表達量并無明顯變化，但對SlCDF3有顯著的促進作用，相比于野生型植株表達量上升5～10倍。筆者推測SlSP5G3基因編碼的FT-like蛋白通過篩管細胞到達頂端分生組織與下游轉錄因子FD結合之后，反饋調節上游SlCDF3基因的表達，具體的作用關系還需進一步驗證。

開花時間的早晚受外界因素調控并直接影響植株的產量。如在大豆中，花期的早晚與結莢率之間呈顯著的相關性，且大豆產量取決于接莢的花數[24]。低緯度地區種植的大豆明顯表現出植株矮小，開花成熟期提前，產量降低。趙薇等[25]研究發現不同春化處理對蠶豆開花和產量產生重要影響，首花時間、鮮莢始收時間最早的蠶豆單株產量最高。赤霉素處理的西紅花開花時間提前，導致開花數量和花絲產量明顯增加[26]。FT-like基因編碼的成花素是控制植物開花時間的重要因子，可以通過改變其表達量進一步調控產量。在番茄sft突變體中，沒有形成完整的多花序結構，導致sft突變體植株變大且伴隨著極少的花序、花和果實[27]。番茄SP基因調節營養生長向生殖生長的轉換。sp突變體植株形成較短的合軸分枝，直到出現2個連續的花序后停止生長[28]，與sp突變體植株相比，sp5gsp突變體開花期提前，收獲指數上升[29]。本試驗發現SlSP5G3基因過表達植株通過延遲開花時間提升了葉片干鮮質量，單果質量和單株產量，與同源基因SlSP5G在控制產量方面存在類似的功能。延遲開花使植物積累更多的營養物質，推遲從營養生長向生殖生長的轉變。葉片中積累了更多的營養物質，提升了地上部生物量。同時建立新的源庫關系模式，提升總產量，為轉基因育種提供新思路。

4 結 論

SlSP5G3受光環境調控，在真葉和子葉中主要表達，且表達量不受生長發育時期的影響；SlSP5G3作為開花抑制因子增加‘Micro-Tom’的開花所需葉片數，延遲開花時間；SlSP5G3促進上游SlCDF3基因的過量表達，提升‘Micro-Tom’番茄的地上部生物量積累、單果質量和單株產量。