冠心病患者血清miR-34a和HIF-1α水平與冠狀動脈側支循環(huán)形成的相關性研究

仉慧穎,耿 威

(大慶油田總醫(yī)院：1.無創(chuàng)檢查科；2.消化內科，黑龍江大慶 163316)

冠心病是由于冠狀動脈功能性改變或器質性病變引起的冠狀動脈血流和心肌需求之間不平衡而導致的心肌損害，是一種常見的心血管疾病，嚴重威脅人們身體健康，半個世紀以來發(fā)病率不斷增加[1]，主要表現(xiàn)為心絞痛、心律失常、心力衰竭[2]。冠狀動脈側支循環(huán)形成一般在冠狀動脈高度狹窄之后，有助于改善心肌供血不足的狀況[3]。研究表明，微小RNA-34a(miR-34a)與血管形成密切相關[4]。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)是缺氧情況下誘導生成的轉錄因子，有研究表明，其與血管生成密切相關[5]，且HIF-1α是miR-34a的靶基因之一[6]。因此本研究通過觀察miR-34a、HIF-1α在冠狀動脈側支循環(huán)患者血清中表達差異，探討血管miR-34a、HIF-1α表達水平與冠心病患者冠狀動脈側支循環(huán)的相關性，以期為冠心病的治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年6月至2018年9月本院收治的98例冠心病患者為冠心病組。納入標準：符合冠心病診斷標準[7]；經冠狀動脈造影檢查存在右冠狀動脈單支、左前降支、左回旋支血管狹窄，狹窄程度大于或等于90%。排除標準：入院24 h內死亡；合并冠狀動脈心肌橋、急性心肌梗死、惡性腫瘤；經皮冠狀動脈介入治療；多臟器受損、腦血管疾病。根據Rentrop分級系統(tǒng)評估，冠狀動脈側支循環(huán)程度將患者分為側支形成組和側支未形成組。Rentrops分級：0級代表無側支循環(huán)；1級為分支動脈充盈，但主要的心外膜動脈未充盈；2級為心外膜動脈出現(xiàn)且只有部分充盈；3級為心外膜動脈出現(xiàn)且完全被充盈[8]。2、3級患者為側支形成組共52例，其中男24例，女28例，年齡42～78歲，平均(56.28±9.12)歲。0、1級患者為側支未形成組共46例，其中男22例，女24例，年齡44～79歲，平均(57.94±7.94)歲。另選取同期體檢健康者58例作為對照組，男30例，女28例，年齡43～80歲，平均(58.12±8.64)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1血液采集 冠心病患者入院12 h內，健康對照組于晨起空腹采取靜脈血5 mL置于EP管內，-4 ℃，3 000 r/min離心20 min，小心吸取上清液置于另一個EP管內，-80 ℃冰箱保存，避免多次凍融。

1.2.2qRT-PCR法檢測 按照Trizol試劑盒操作說明書提取血清總RNA，并通過反轉錄酶試劑盒Superscript Ⅲ將RNA反轉錄合成cDNA。采用Real Master Mix試劑盒并利用SYBR Green Ⅰ染料進行實時熒光定量PCR檢測血清miR-34a表達水平，程序設定為95 ℃ 預熱30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。以U6為內參基因，引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反應結束后收集數據，并對所得數據Ct值進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-34a相對表達量。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附免疫試驗(ELISA)檢測 采用ELISA檢測血清HIF-1α水平，試劑盒為人HIF-1α酶免檢測試劑盒(江萊生物技術有限公司)，嚴格按照產品操作說明書進行。

表1 qRT-PCR引物序列設計

表2 3組一般資料比較

2 結 果

2.1一般資料比較 3組研究對象性別、年齡、BMI、膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、有無吸煙史、飲酒史等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.23組血清miR-34a和HIF-1α水平比較 3組血清miR-34a、HIF-1α水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組相比，側支未形成組血清miR-34a水平無明顯變化(P>0.05)、血清HIF-1α水平明顯升高(P<0.05)；側支形成組血清miR-34a水平明顯降低(P<0.05)，血清HIF-1α水平明顯升高(P<0.05)。與側支未形成組相比，側支形成組血清miR-34a水平明顯降低(P<0.05)，血清HIF-1α水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

2.3血清miR-34a、HIF-1α水平對冠狀動脈側支形成的診斷價值 ROC曲線顯示，血清miR-34a水平預測冠心病患者發(fā)生冠狀動脈側支循環(huán)形成曲線下面積為0.895，截斷值為0.56，敏感度為90.4%，特異度為84.8%。血清HIF-1α水平預測冠心病患者發(fā)生冠狀動脈側支循環(huán)形成的曲線下面積為0.909，截斷值為21.38 ng/mL，敏感度為91.3%，特異度為90.4%，見圖1。

2.4冠心病患者側支循環(huán)形成的影響因素分析 以是否發(fā)生側支循環(huán)形成為因變量，以年齡、BMI、TC、TG、miR-34a、HIF-1α為自變量并進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示miR-34a、年齡是側支循環(huán)形成的保護因素，HIF-1α、TG是側支循環(huán)形成的危險因素，見表4。

表3 血清miR-34a和HIF-1α水平表達情況

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與側支未形成組比較

圖1 血清miR-34a(A)、HIF-1α(B)水平對冠狀動脈側支形成的診斷價值

表4 多因素Logistic回歸分析

3 討 論

冠心病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變引起的管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病。側支循環(huán)的形成有助于改善冠心病患者心肌缺血的癥狀。miRNA是一類由22個左右的核苷酸組成內源性非編碼RNA，性質較穩(wěn)定，不受性別、年齡等一般情況影響，在心血管疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[9]。有研究表明，miR-34a參與心血管疾病的發(fā)病過程[4]。另有研究表明HIF-1α與血管生成密切相關[5]，且HIF-1α是miR-34a的靶基因[6]，因此本研究主要探討血清miR-34a、HIF-1α水平與冠心病患者側支循環(huán)形成的關系。

側支循環(huán)的建立可有效緩解心肌缺血狀態(tài)，對控制心絞痛發(fā)作、減少心肌梗死范圍、降低室壁瘤發(fā)生風險、改善患者預后具有重要意義。研究表明，側支循環(huán)的建立受冠狀動脈狹窄程度的影響，但與病變支數無關[10]。TABUCHI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血內皮祖細胞中miR-34a水平明顯高于非冠心病患者，miR-34a水平與內皮祖細胞數量呈負相關，而內皮祖細胞在血管修復過程中發(fā)揮重要作用[12]。據此推測，miR-34a在冠心病患者中可能發(fā)揮抑制血管新生的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈側支循環(huán)形成的冠心病患者血清miR-34a水平明顯低于冠狀動脈側支循環(huán)未形成患者，提示miR-34a在冠狀動脈側支循環(huán)形成過程中發(fā)揮重要作用。血清miR-34a判定冠心病患者側支循環(huán)形成的曲線下面積為0.895，敏感度、特異度均大于80%，提示血清miR-34a可作為判斷側支循環(huán)建立的指標，截斷值為0.56，提示當血清miR-34a水平低于0.56時，側支循環(huán)形成的可能性較大。Logistic回歸分析也顯示血清miR-34a低表達是冠狀動脈側支循環(huán)形成的保護因素。

HIF-1α在缺氧條件下表達明顯增加，轉至細胞核，啟動多種基因表達，誘導新生血管生成。此外，白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α也可誘導HIF-1α生成[13-16]。本研究中，冠心病患者(側支形成組、側支未形成組)血清HIF-1α均高于健康人，提示可能是心肌缺血、缺氧、炎癥共同促進HIF-1α水平升高。BULYSHEVA等[17]研究表明，HIF-1α過表達豬心肌梗死區(qū)域新生血管條數高于正常豬。本研究中，側支循環(huán)形成患者血清HIF-1α水平明顯高于側支循環(huán)未形成患者，提示血清中高水平HIF-1α可能促進冠狀動脈側支循環(huán)形成。LIN等[18]研究表明，HIF-1α是miR-34a的靶基因，miR-34a可通過負調控HIF-1α表達，參與糖尿病相關耳蝸毛細胞凋亡，猜測在冠心病患者中，miR-34a也可能調控HIF-1α表達參與冠狀動脈側支循環(huán)形成過程，但本研究未對miR-34a、HIF-1α關系做研究，還有待進一步驗證。本研究ROC曲線顯示，血清HIF-1α水平預測冠心病患者側支循環(huán)形成的曲線下面積為0.909，敏感度和特異度均高于90%，截斷值為21.38 ng/mL，提示當血清HIF-1α水平高于21.38 ng/mL時，側支循環(huán)形成的可能性較大。此外Logistic回歸分析也顯示血清HIF-1α低水平是冠狀動脈側支循環(huán)形成的危險因素，提示高水平HIF-1α有助于冠狀動脈側支循環(huán)形成，改善心肌缺血。

綜上所述，冠心病患者側支循環(huán)形成者血清miR-34a水平降低，血清HIF-1α水平升高，檢測血清miR-34a、HIF-1α水平有助于預測冠心病患者側支循環(huán)形成情況，從而合理用藥。本研究也存在一定不足，miR-34a如何調控HIF-1α參與側支循環(huán)的具體機制還有待進一步研究。此外，本研究樣本數過少，后續(xù)需進行大樣本、多中心實驗進一步證實。