慢性髓細胞白血病患者Th1及CD8+T淋巴細胞水平與療效的相關性分析*

代景瑩，鄒孟穎，楊 曦，魏 卿，王 宇，李 慧，黃曉兵，王曉冬△

(1.電子科技大學附屬四川省人民醫院血液科，成都 611731；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院血液科，成都 610072；3.中國科學院四川轉化醫學研究醫院，成都 610072)

慢性髓細胞白血病(CML)以出現Ph染色體而形成BCR-ABL融合基因為特征[1]，在酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)時代，CML的療效得到了革命性的改善[2]，而更新的TKI還表現出除抗腫瘤作用之外的顯著免疫調節功效，如第二代TKI達沙替尼[3-4]。有部分CML患者當前可進入無治療觀察階段[5]。但目前仍有部分患者不可避免地發生疾病進展[6]，且目前對于首選TKI、換藥指征、停藥決策等問題尚無明確統一定論，筆者認為可從免疫狀態評估的角度對CML患者的上述問題進行指導，通過免疫指標的特點與臨床療效之間的相關性研究，可評估患者為處于優勢或劣勢免疫狀態，從而協助指導是否應更早更換為兼具抗BCR-ABL及免疫調節功效的藥物以更好地改善療效，亦可協助患者的療效預測、預后評估，甚至在患者的停藥策略等問題上起到一定指導意義。而目前認為抗腫瘤免疫主要由細胞免疫應答模式介導，其中輔助性T淋巴細胞1(Th1)及效應性T淋巴細胞CD8+T淋巴細胞發揮著最為重要的作用[7-9]。由此，筆者對CML患者的Th1及CD8+T水平進行了檢測，并將其與臨床療效的相關性進行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究納入2018年2-12月于四川省人民醫院血液科就診，并確診為CML的患者。納入的所有患者均通過骨髓細胞形態學、細胞遺傳學及分子生物學檢查確診，符合國內統一的診斷與分期標準。本研究檢測、分析了納入患者的外周血Th1及CD8+T淋巴細胞水平，并均按照患者進行采血檢測當日的狀態，對患者進行臨床緩解狀態的評估。其中，初診組、細胞遺傳學完全緩解(CCyR)組及分子學緩解4.5(MR4.5)組患者的比較中：初診組10例，男7例，女3例，中位年齡32.5歲(19.0～74.0歲)；CCyR組13例，男10例，女3例，中位年齡64.0歲(25.0～70.0歲)；MR4.5組67例，男39例，女28例，中位年齡46.0歲(17.0～78.0歲)。Th1高CD8+T高組與Th1高CD8+T非高組、Th1低CD8+T高組患者的比較中(Th1高與CD8+T高指Th1比例值與CD8+T比例值高于正常范圍上限，CD8+T非高指CD8+T比例值為正常范圍內或低于正常范圍下限，Th1低指Th1比例值低于正常下限)：Th1高CD8+T高組15例，男8例，女7例，中位年齡49.0歲(17.0～78.0歲)；Th1高CD8+T非高組17例，男10例，女7例，中位年齡48歲(17.0～84.0歲)；Th1低CD8+T高組10例，男8例，女2例，中位年齡34歲(26.0～61.0歲)。本研究為回顧性研究，符合與人相關研究倫理學標準并得到醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1T淋巴細胞亞群的檢測 采集患者外周血并通過流式細胞學技術檢測其T淋巴細胞亞群CD8+T淋巴細胞比例(CD8+T/Lymphocyte)與Th1細胞比例(Th1/CD4+T)。CD8+T淋巴細胞比例引用四川省人民醫院流式細胞檢測報告中的正常參考范圍(17.6%～30.4%)，Th1細胞比例(Th1/CD4+T)引用海斯特檢驗機構的正常參考范圍(11.8%～25.8%)。采用BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀進行檢測，所需的免疫熒光抗體均購自美國BD公司。(1)Th1細胞比例的檢測：全血+RPMI1640培養基混勻，然后加入刺激劑[包括布雷非德菌素A、佛波醇酯(PMA)、離子霉素]在培養箱中培養孵育4 h，取出并加入相應熒光素標記的抗體(抗CD3抗體、抗CD8抗體)，混勻之后于室溫孵育20 min。再加入10×紅細胞裂解液(BD FACS Lysing Solution)，震蕩，室溫10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗后，加入相應的固定劑，孵育30 min，PBS洗2遍，其后加入干擾素-γ(IFN-γ)抗體，孵育20 min，其后PBS洗1遍，加入適量PBS重懸待上機檢測。Th1細胞的表面標志為CD3+CD4+，而當用PMA刺激4 h時，會發現CD4+細胞明顯減少，甚至消失，這是因為PMA會誘發細胞表面CD4分子被內吞。所以本研究用CD3和CD8反設CD4細胞，即CD3+CD8-細胞被認為是CD3+CD4+細胞。(2)CD8+T/Lymphocyte的檢測：紅細胞裂解液裂紅處理15～20 min，離心，加入相應熒光素標記的抗CD45抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體避光4 ℃孵育20 min，PBS洗后離心，重懸于適量PBS中待上機檢測。數據分析采用Diva流式數據分析軟件進行。

1.2.2療效評估 治療反應定義與療效評估標準參照中國慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016年版)[10]：CCyR定義為Ph+細胞為0；主要分子學緩解(MMR)定義為BCR-ABLIS≤0.1%；MR4.5定義為BCR-ABLIS≤0.003 2%?；诒狙芯炕颊呃龜递^少，并考慮到分析、比較仍具有價值及指導意義，本研究中未緩解指未達到CCyR的患者，包括血液學緩解但未達到CCyR的患者及未達到血液學緩解的患者。

2 結 果

2.1初診組、CCyR組及MR4.5組患者Th1/CD4+T分析 本研究分析了CML患者初診未治療時(n=10)、治療后獲得CCyR時(n=13)及治療后獲得MR4.5時(n=67)的Th1水平(Th1/CD4+T)，發現70.00%的初診組患者Th1/CD4+T低于正常范圍下限(Th1/CD4+T引用海斯特檢驗機構的正常參考范圍11.8%～25.8%),CCyR組、MR4.5組分別只有15.38%、15.15%的患者Th1/CD4+T低于正常下限。初診組的Th1降低率高于CCyR組及MR4.5組，差異均有統計學意義(P=0.01、0.00)，見圖1。另一方面，初診組患者Th1/CD4+T值(9.98±7.68)%低于CCyR組(21.27±10.77)%及MR4.5組(21.16±10.17)%，差異均有統計學意義(P=0.01、0.00)，見圖2。

圖1 初診組、CCyR組及MR4.5組Th1/CD4+T低于正常范圍下限的患者百分比比較

2.2Th1高CD8+T高組與Th1高CD8+T非高組臨床緩解狀態比較 Th1水平可促進CD8+T淋巴細胞的活化與增殖、進一步發揮細胞免疫應答的效應，而由于在臨床中觀察發現Th1及CD8+T水平均高于正常上限的患者具有更優的緩解狀態，本研究進一步比較Th1高CD8+T高組患者(n=15)與Th1高CD8+T非高組患者(n=16)臨床緩解狀態(CD8+T/Lymphocyte值參考醫院流式細胞檢測報告中正常參考范圍17.6%～30.4%)，結果顯示86.67%的Th1高CD8+T高組患者及52.94%的Th1高CD8+T非高組患者達到MR4.5，兩組MR4.5率比較，差異有統計學意義(P=0.03)；而13.33%的Th1高CD8+T高組患者及17.65%的Th1高CD8+T非高組患者為未緩解，兩組的未緩解率比較，差異無統計學意義(P=0.74)，見圖3。

圖2 初診組、CCyR組及MR4.5組患者Th1/CD4+T比較

A：Th1高CD8+T高組；B：Th1高CD8+T非高組

圖3 Th1高CD8+T高組與Th1高CD8+T非高組臨床緩解狀態比較

A：Th1高CD8+T高組；B：Th1低CD8+T高組

圖4 Th1高CD8+T高組與Th1低CD8+T高組臨床緩解狀態比較

2.3Th1高CD8+T高組與Th1低CD8+T高組臨床緩解狀態比較 臨床中觀察發現Th1/CD4+T值低于正常下限，且CD8+T比例值高于正常上限的患者更多地表現出不良的臨床療效與緩解狀態，由此本研究進一步比較Th1高CD8+T高組患者(n=15)與Th1低CD8+T高組患者(n=10)臨床緩解狀態，結果顯示：86.67%的Th1高CD8+T高組患者及20.00%的Th1低CD8+T高組患者達到MR4.5，兩組MR4.5率比較，差異有統計學意義(P=0.00)；而13.33%的Th1高CD8+T高組患者及80.00%的Th1低CD8+T高組患者為未緩解，兩組未緩解率比較，差異有統計學意義(P=0.00)，見圖4。

3 討 論

隨著對腫瘤免疫的認識不斷深入，對腫瘤患者的免疫狀態評估及免疫分層在臨床治療方案選擇、療效評價、預后評估等方面有著重要指導意義[11-12]，而以提高患者自身抗腫瘤免疫力為目標的各種免疫治療策略亦得到了快速及有效的發展[13-15]。目前認為體內抗腫瘤主要由細胞免疫應答模式介導，而其中Th1為主導體內向細胞免疫應答模式轉化的重要輔助性T淋巴細胞亞群，它分泌IFN-γ、白細胞介素-2(IL-2)等Ⅰ型免疫應答細胞因子而提供給CD8+T淋巴細胞徹底活化的第3信號，從而促進CD8+T淋巴細胞的活化與增殖，CD8+T淋巴細胞作為細胞免疫應答中的效應性T淋巴細胞進一步執行最終識別及有效清除癌細胞的任務[7-9]。筆者前期研究亦發現，Th1水平的升高與臨床療效呈正相關[16]。由此，Th1及CD8+T淋巴細胞為抗腫瘤細胞免疫應答中起著最為關鍵作用的兩個T淋巴細胞亞群。基于此，筆者認為對CD8+T淋巴細胞及Th1水平的監測對于腫瘤患者的抗腫瘤免疫力評估、療效預測及預后評估等可能具有一定的指導意義，且Th1及CD8+T淋巴細胞水平的檢測通過流式細胞術實現具有檢測方法較簡單、成本低、作為臨床長期免疫監測指標可行性強等優點。由此，筆者所在課題組對長期診療、隨訪的CML患者進行了Th1水平(Th1/CD4+T)及CD8+T水平(CD8+T/Lymphocyte)的檢測與分析。

研究結果顯示，Th1高CD8+T高的患者表現出較Th1高CD8+T非高的患者更高的MR4.5率(P=0.03)，提示Th1及CD8+T雙高的患者具有更深的緩解度。另一方面，本研究將Th1高CD8+T高的患者與Th1低CD8+T高的患者進行比較，發現前者的MR4.5率明顯高于后者(P=0.00)，而前者的未緩解率卻明顯低于后者(P=0.00)，提示Th1高CD8+T高的患者具有更高的緩解率與更深的緩解度。本研究上述結果均提示，Th1高CD8+T高的患者有更大的概率獲得更好的療效及更優的預后。

除此之外，本研究還對初診未治療時CML患者的Th1水平進行了分析，并與治療后達到CCyR或MR4.5的患者進行比較，發現治療后獲得CCyR或MR4.5的患者Th1/CD4+T值均較初診患者高(P=0.01、0.00)；另一方面，初診未治療患者Th1/CD4+T值低于正常下限的患者比例增多，70.00%的初診組患者Th1/CD4+T值低于正常下限，而僅有15.38%的CCyR組患者及15.15%的MR4.5組患者其Th1/CD4+T值低于正常下限，提示初診未治療患者的Th1水平顯著低下。筆者推論治療后患者若發生良好的治療反應并逐漸獲得更深的緩解深度，其自身機體免疫力將得到相應的恢復與提升，從而具備更強的自身抗腫瘤免疫力，利于進一步有效清除體內殘存的腫瘤細胞，這一假設推論與本研究觀察得到的結果一致，即在治療后獲得良好的緩解情況伴隨著Th1水平的顯著提升。由此，Th1水平的監測對于患者的療效預測與預后評估可起到一定指導意義。

值得注意的是，筆者所在課題組前期研究亦已分析了不同TKI治療后患者的免疫指標特點，結果顯示達沙替尼組患者的Th1水平明顯高于尼洛替尼組及伊馬替尼組，顯示出達沙替尼特有的免疫調節作用[16]。但筆者所在課題組進一步分析，達沙替尼組、尼洛替尼組及伊馬替尼組中各自分別均有緩解良好及緩解不理想的患者，而3組中緩解不理想的患者均常常伴隨著不理想的免疫指標狀況，由此，本文旨在單從免疫學的角度進行分析(而并不考慮患者使用何種TKI治療的因素)，以探索免疫指標Th1及CD8+T淋巴細胞與療效的相關性，以期在CML臨床診療中起到一定的指導意義，并在本研究中證實了免疫指標Th1及CD8+T淋巴細胞對療效預測具有一定指導意義。

綜上所述，初診未治療CML患者表現出低下的Th1水平，而治療后Th1水平的提升預示更好的治療反應；治療后Th1及CD8+T雙高提示更高的臨床緩解率及更深的緩解度，而Th1低CD8+T高提示不理想的臨床狀態。因此，Th1水平及CD8+T淋巴細胞水平可作為臨床對CML患者的長期規律免疫監測指標，以助于評估患者免疫狀態，并對CML患者的臨床療效預測起到一定的指導作用。