云南地方有色米種質資源多樣性及Rc基因的遺傳變異分析

李 霞，杜 娟，楊曉夢，普曉英，楊加珍，曾亞文

(云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】云南是中國稻種最大的遺傳多樣性中心和亞洲栽培稻秈粳分化中心[1]，其中有色米資源十分豐富，幾乎占云南地方稻種資源的一半[2]。有色稻米種皮富含天然色素，具有很強的抗氧化性和自由基清除功能，在抗癌、抗炎癥、抗菌、保護視力、預防心血管疾病和糖尿病等方面都具有重要生理功能[3-5]。目前針對水稻種質資源多樣性研究報道較多[6-8]，但對有色米遺傳多樣性的研究確相對薄弱，因此，對云南有色米種質這一寶貴資源的開發與利用，對中國功能稻米育種發展將起到積極的推動作用，同時也將有效促進云南地方特色健康產業的快速發展。【前人研究進展】國外學者對紅米種皮顏色基因的研究發現，該基因位點位于第7染色體，隱性白米種皮無著色是源于Rc基因第6外顯子的14 bp的缺失區段，缺失導致該基因失去功能[9]。國內學者通過對長雄野生稻、紅寶石及紅米品種培雜191的種皮顏色基因定位也得到相似的結論，初步定位結果均顯示種皮顏色基因位于第7染色體上，紅白米之間Rc基因存在類似的缺失變異[10-12]。【本研究切入點】以來自云南省23個州、縣的35份地方水稻種質資源為研究對象，利用分子標記技術對其進行遺傳多樣性分析；同時探究已報道的Rc基因在上述35份種質材料中的遺傳變異。【擬解決的關鍵問題】作為云南地方稻種資源的代表，有色米有著重要的社會及經濟價值，對云南地區有色米的遺傳多樣性分析及相關功能基因的鑒定，將實現有色米在分子水平上的分類，有效解決有色米資源鑒定的精度及準確度問題，對有色米資源的保護及利用提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所功能食品作物課題組，收集并篩選出來自23個州、縣具有代表性的云南地方種質資源35份，其中包括23份紅米地方種質資源和2份黑米種質資源(表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 田間取幼嫩葉片，CTAB小樣法提取基因組總DNA，紫外分光光度計檢測DNA質量及濃度，稀釋到50 ng/μl備用。

1.2.2 PCR體系 引物：本實驗所選用的的24對水稻SSR引物均勻分布于12條染色體上，來自于http://www.gramene.org，由昆明碩擎有限公司合成。PCR反應體系總體積為10 μl：2×TsingKe Master Mix 5 μl，50 ng/μl DNA模板1.5 μl，上下游引物各0.5 μl，最后以2.5 μl ddH2O補平。2×TsingKe Master Mix 購買自昆明碩擎有限公司。 PCR 反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，64～55 ℃(touch-down PCR)退火30 s，72 ℃下延伸30 s，10個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃ 延伸5 min。擴增產物用8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色后置于白熾燈箱上照相、記錄。

1.2.3 數據分析 根據每個SSR標記在參試各品種相同遷移率位置上(以DNA Marker作為標準)顯示條帶的有無記錄，有帶記為1，無帶賦值0，建立1，0型二元矩陣。計算材料間遺傳相似系數(GS)參照Nei和Li的方法[13]，公式：GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中，Ni為材料i中出現的擴增片段數目，Nj為材料j中出現的擴增片段數目，Nij為材料i和j共有的擴增片段數目。利用GS值按不加權成對群算術平均法(UPGMA)和SHAN程序進行遺傳相似性聚類分析。利用NTSYS-pc2.1[14]軟件生成樹狀聚類圖。

表1 各品種名稱及米色性狀調查

續表1 Continued table 1

編號Number品種名稱Variety name原產地Origin秈/粳Indica/Japonica 米色Rice color15五里香廣南縣粳紅米16黃殼糯保山市粳白米17旱揚谷羅平縣粳白米18小硬糯新平縣粳黑米19烏嘴谷鳳慶縣粳白米20長毛背子谷墨江縣粳紅米21西洋谷富寧縣粳紅米22大花糯墨江縣粳紅米23灰谷騰沖市粳紅米24紅吊糯石屏縣秈黑米25毫毫孟連縣秈紅米26老鼠牙江川縣秈紅米27灰皮紫糯版納州秈紅米28冷水谷墨江縣秈紅米29南高谷臨滄市秈紅米30小白糯云 縣秈紅米31大墨谷墨江縣秈紅米32冷水香屏邊縣秈紅米33馬田谷大關縣秈紅米34細白谷臨滄市秈紅米35紅米寒窩電景洪市秈紅米

2 結果與分析

2.1 SSR引物的多態性

24對SSR引物均能得到清晰且重復性好的條帶，在35份親本材料中共檢測到78個等位變異，其中單個引物可擴增出1～6個等位變異，平均每個引物可檢測到2.2個等位變異。引物RM3513和RM6356均能檢測到6個等位變異(表2)。

表2 SSR標記信息

圖1 云南地方有色米種質資源多樣性聚類分析Fig.1 Cluster analysis of diversity of local colored rice germplasm in Yunnan province

2.2 遺傳相似系數(GS)與聚類分析結果

根據SSR標記計算親本間遺傳相似系數，其變幅為0.59～0.97，平均值為0.78，結果如圖1所見。來自新平縣的地方有色米種質資源小硬糯與來自鳳慶縣的白米地方種質資源烏嘴谷遺傳相似系數最高，為0.97，表明二者親緣關系最近；其次為孟連縣的紅米種質毫毫與新平縣的白米種質小矮腳糯(0.9348)。在35份地方種質中新平縣的小矮腳糯與耿馬縣的木邦谷間的遺傳相似系數最低，為0.57，表明二者親緣關系最遠；而同為新平縣的地方種質小矮腳糯與小硬糯并未表現出較高的遺傳相似性，遺傳相似系數僅為0.84。在GS值為0.59處，35份材料可分為2大類，基本上是以粳稻和秈稻為主要區分歸類標準。在GS值為0.69處，第一亞類又可以分為2組，第1組有14份材料，第2組有2份材料；第二亞類在此處也可以分為2組，第1組有22份材料，第2組有1份材料。從兩大亞類所包含的材料遺傳多樣性來看，粳稻組所包含的材料遺傳相似系數主要集中在0.78～0.88，而秈稻組材料間遺傳相似系數主要集中在0.88～0.97，這表明在云南地方品種中粳稻間的遺傳多樣性較秈稻更豐富。總體來看云南地方種質資源中，同一來源地的地方品種遺傳差異較大，究其原因與云南地區特有的復雜地理及氣候條件有較大關系。

2.3 Rc基因在25份有色米材料中的遺傳變異

利用已報道的水稻紅米種皮顏色基因Rc序列，針對第6外顯子內的14 bp的缺失差異區段設計功能特異引物：GXL：5’-TGAAGGAAGTGATGACAACAAGACC-3’，GXR5’-ATGGTTGGCACTGAAATCACCTTGG-3’，對25份有色米資源進行標記檢測,結果表明， 35份云南地方水稻資源中，紅米Rc基因表現為野生型，白米Rc基因表現為突變型，且突變類型與已報道的突變位點一致，均表現為第6外顯子內的14 bp的缺失，這與前人報道結果相似。同時2份黑米材料Rc基因也發生了類似的缺失突變(圖2)，這與梁婷婷[15]的報道類似，再次說明黑米和紅米呈色物質應由不同的代謝途徑產生。

3 討 論

3.1 云南地方有色稻米的遺傳多樣性

水稻是世界一半人口的主要糧食，種植歷史悠久，稻種資源極為豐富。隨著人們生活水平的提高，功能型水稻也越來越受到重視[16]，其中有色米作為代表之一，在中國地方水稻資源中有著多樣類型及廣泛分布。就種皮的顏色而言，可分為紫黑米、紅米、黃米和綠米，其中以紫黑米和紅米最常見。有色米主要分布在云貴高原和華南一帶，其中以云南、廣西、湖南、貴州省居多[17-18]。云南地方稻種資源中有色米資源十分豐富，幾乎占云南地方稻種資源的一半，其中51.23 %是秈稻，48.77 %的是粳稻，集中分布在滇南單、雙季秈稻區域[19-20]。通過對35份云南地方種質(其中25份為有色米資源)的遺傳多樣性分析發現，基本上是以粳稻和秈稻為主要劃分標準。從兩大亞類所包含的材料遺傳多樣性來看，粳稻組材料遺傳相似系數主要集中在0.78～0.88，而秈稻組材料間遺傳相似系數主要集中在0.88～0.97，這表明云南地方品種粳稻間的遺傳多樣性較秈稻地方種更豐富。總體來看云南地方種質資源，同一來源地的地方品種遺傳差異較大，究其原因與云南地區特有的復雜地理及氣候條件有較大關系。

圖2 紅米白米及黑米的Rc基因第六外顯子的序列差異Fig.2 Sequence differences in the sixth exon of Rc in red rice, white rice and black rice

3.2 水稻紅米Rc基因在云南地方水稻種質資源中的遺傳變異

隨著生物技術的不斷進步，對有色稻米的研究轉入更深層次的分子水平，即有色米種皮顏色基因的定位與克隆。國外學者研究發現紅米種皮顏色基因位點位于第7染色體，隱性白米種皮無著色是源于Rc基因第6外顯子內的14 bp缺失，缺失導致框架改變而使該基因失去功能[9]。國內學者通過對長雄野生稻、紅寶石及紅米品種培雜191的種皮顏色基因定位也得到相似的結論，初步定位種皮顏色基因位于第7染色體上，紅白米之間Rc基因存在類似的缺失變異[10-12]。對35份云南地方水稻資源中Rc基因變異檢測結果表明，紅米Rc基因表現為野生型，白米Rc基因表現為突變型，且突變類型與已報道的突變位點一致，均表現為第6外顯子內的14 bp缺失。同時2份黑米材料Rc基因也發生了類似的缺失突變，這與梁婷婷[15]結果一致。通過對不同來源的白米、紅米及紫黑米品種Ra及Rc位點的基因型鑒定。紅米品種為raraRcRc型，黑米品種為RaRarcrc型，而白米品種則為rararcrc型。這說明不同顏色的有色米，花青素物質的積累可能通過調控不同的結構基因來實現。由于分子標記輔助選育已在水稻育種中廣泛應用[21]，以上Rc基因的變異信息將為云南有色米的分子標記育種提供依據，

4 結 論

在云南地方品種中粳稻間的遺傳多樣性較秈稻地方種更豐富。總體來看云南地方種質資源，同一來源地的地方品種遺傳差異較大，究其原因與云南地區特有的復雜地理及氣候條件有較大關系。35份云南地方水稻資源中，紅米Rc基因表現為野生型，白米rc基因表現為突變型，且突變類型與已報道的突變位點一致，均表現為第6外顯子內的14 bp的缺失。云南地方品種中粳稻間的遺傳多樣性較秈稻地方種更豐富。總體來看，云南地方種質資源中同一來源地的地方品種遺傳差異較大。