轉2mG2-epsps基因耐草甘膦玉米T抗-4對非靶標除草劑的耐受性評價

余桂容，宋 軍，陳 謙，張 維，徐利遠, 杜文平*

(1.四川省農業科學院生物技術核技術研究所，四川 成都 610066；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081)

【研究意義】隨著全球人口的不斷增多，人類對糧食作物需求也日益增多，傳統的農作物遺傳育種已無法完全滿足人類日益增長的需求，轉基因工程技術的出現為農作物育種提供了全新的廣闊前景[1]。【前人研究進展】根據國際農業生物技術應用服務組織報道，轉基因作物至1996年商業化種植以來，在全球范圍內取得迅速發展。截至2017年，全球轉基因作物種植面積達到1.898億公頃[2]。轉基因技術自誕生以來，生物安全問題相伴而生。在轉基因作物的研究和產業化過程中，轉基因作物的安全性是最受關注也是必須要保證的關鍵問題[3]。隨著第二代轉基因作物的商業化，外源基因和轉基因作物種類的增加，其安全性引發了越來越激烈的爭論[4]，由于轉基因作物會產生抗性而導致超級雜草、基因漂移的可能性等說法會引發環境安全，更加提高了公眾對轉基因作物及產品安全性的擔憂，并在許多國家成為轉基因作物推廣的強大阻力。有關轉基因作物的爭論主要集中在以下幾點：轉基因作物的食品安全性、環境安全性、標記基因安全性及長期生態效應[5-6]。按國際慣例，轉基因生物安全性主要分為環境安全性與食用安全性評價。在環境安全上，研發人在關注法律法規要求的安全性測試數據的同時，還應針對生產實踐中可預見的影響轉基因玉米可持續利用的潛在問題制定科學的解決預案[7]。如何科學地評估轉基因作物的安全性， 并將風險評估和風險管理給公眾清晰明確、值得信任的答案，是科學界和政策決策者所要深思的問題[8]。由于長期種植耐除草劑和抗蟲轉基因作物所帶來的高度選擇壓力，靶標生物的抗性問題也越來越引起人們的重視[9]。因此，研究轉基因作物對非靶標除草劑的耐受性，不能讓轉基因作物成為人們擔心的那樣產生靶標除草劑的抗性后成為超級雜草，減少和消除公眾對轉基因作物安全性的擔憂，這是轉基因作物環境安全評價的重要內容。迄今，關于耐除草劑性狀轉基因玉米對非靶標除草劑耐性的報道甚少。【本研究切入點】本項目在明確T抗-4耐受靶標除草劑草甘膦功能有效性的基礎上，開展轉化體T抗-4綜合農藝性狀評價以及對非靶標除草劑的耐受性評價試驗。結合農業生產實踐，本項目選取常規玉米田間普遍施用的除草劑、常規玉米敏感的除草劑以及非選擇性、滅生性除草劑。【擬解決的關鍵問題】作為非靶標除草劑的研究對象，以期為全面評價玉米轉化體T抗-4的環境安全提供基礎試驗數據。

1 材料與方法

1.1 玉米材料

轉2mG2-epsps基因耐除草劑草甘膦玉米T抗-4及其對應的非轉基因玉米材料18599按照農業部中間試驗批文號農基安辦報告字2018第358號批復于2018年4月20日至2018年8月30日種植于四川省農科院植物高新技術育種示范園。2mG2-epsps抗除草劑草甘膦基因來源于中國農業科學院生物技術研究所從土壤微生物中克隆的自主專利基因[10]，玉米T抗-4是四川省農業科學院生物技術核技術研究所用西南骨干玉米自交系18599作為受體親本轉導2mG2-epsps基因獲得的高效表達材料。

1.2 非靶標除草劑

1.2.1 適用玉米除草劑 煙嘧磺隆：普通飼用玉米常用的苗后除草劑。本項目使用的煙嘧磺隆的商品名為“玉公孫”(生產商，山東奧坤)，劑型為10%的可分散油懸浮劑，每667 m2按有效成分133.3 mg/L噴施30 L(圖1A)。硝磺草酮-莠去津：玉米田常用的廣譜性復配除草劑。本項目使用的混劑的商品名為“玉律”(生產商，德州祥龍)，劑型為25 %的可分散油懸浮劑，每667 m2按有效成分833.3 mg/L噴施30 L(圖1B)。

1.2.2 玉米敏感除草劑 精喹禾靈：適用作物包括大豆、油菜、闊葉蔬菜等多種作物及果樹、林業苗圃等。玉米對精喹禾靈敏感，誤施或鄰近地塊施藥，霧滴飄移到玉米植株上都會產生藥害。本項目使用的精喹禾靈的商品名為“風華精銳”(生產商，山東豐澤)，劑型為10 %的乳油，每667 m2按有效成分166.7 mg/L噴施30 L(圖1C)。

1.2.3 滅生性除草劑 草銨膦：屬于非選擇性、觸殺型除草劑。本項目使用的草銨膦的商品名為“隔日樂”(生產商，河北國美)，有效成分草銨膦的含量為10 %，劑型為可溶液劑。每667 m2按有效成分1666.7 mg/L噴施30 L(圖1D)。

1.3 試驗方法

1.3.1 綜合農藝性狀評價 參照《NY/T 1209-2006：農作物品種試驗計數規程玉米》。農藝性狀調查指標包括：播期、出苗期、成苗率、抽雄期、吐絲期、散粉期、完熟期、株高、穗位、葉片數、花絲顏色、花藥顏色、株型等。室內考種調查指標包括：穗長、穗粗、禿尖長度、禿尖率、穗行數、行粒數、穗粒數、百粒重等。采用3次重復試驗設計，小區面積100 m2，最終換算667 m2產量。

1.3.2 對非靶標除草劑的耐受性評價 ①試驗設計：3次重復，5 m行長，1行區，行距60 cm，株距25 cm，不同重復之間有1 m的過道。小區面積為3 m2(5 m × 0.6 m )。常規栽培管理。小區設計示意圖(圖2)。在轉基因玉米和對照材料長至三葉一心至五葉一心時噴施除草劑，噴施濃度分別為田間推薦劑量中量的1和2倍以及不噴施除草劑的清水對照。選壓力穩定帶扇形噴頭的噴霧器進行施藥，保證使藥劑均勻分布到整個小區，所用器械類型為三燕牌背負式電動噴霧器(型號：3WBD-16)，工作壓力為0.15～0.4 MPa，不銹鋼四噴頭，長度70 cm，噴施高度50 cm(圖3)。②試驗處理：轉基因玉米不噴施除草劑； 轉基因玉米噴施非靶標除草劑；對應的非轉基因玉米不噴施除草劑；對應的非轉基因玉米噴施非靶標除草劑。③數據調查：分別在用藥后1、2和4周調查和記錄成苗率、植株高度(選取最高的5株)、藥害癥狀(選取藥害癥狀最輕的5株)。藥害癥狀分級按GB/T 19780.42執行。a.如果藥害能被計數或測量，則用絕對數值表示，例如植株數(噴藥株數、死亡株數)或植株高度(選取最高的5株)。b.用藥1周后，根據藥害癥狀，給每個處理藥害定級(表1)。除草劑受害率按公式(1)計算。

“0×、1×、2×”表示噴施除草劑中劑量的0、1、2倍圖2 非靶標除草劑耐性有效性評價小區設計Fig.2 Plot design for evaluation of tolerance effectiveness of non-target herbicides

左為背負式電動噴霧器，右為四聯扇形噴頭圖3 試驗用噴施器械 Fig.3 Spraying apparatus for the test

表1 藥害級別及其癥狀

表2 T抗-4田間物候期性狀調查

注：同列數據采用LSD法檢驗差異顯著性(α=0.05)。

Note: LSD method was used to test the significance of the same column of data (α= 0.05).

表3 T抗-4田間表型性狀調查

注：同列數據采用LSD法檢驗差異顯著性(α=0.05)。

Note: LSD method was used to test the significance of the same column of data(α=0.05).

(1)

式中：X——受害率，單位為百分率( %)；N——同級受害株數；S——級別數；T——總株數；M——最高級別。

除草劑噴施時間為2018年5月11日。在噴施除草劑溶液1周(18/5)，2周(25/5)和4周(7/6)后，觀察不同材料和噴施濃度處理的田間表現、調查藥害情況和株高。

2 結果與分析

2.1 玉米轉化體T抗-4綜合農藝性狀

在無除草劑處理條件下，田間物候期性狀T抗-4成苗率為(85.0±2.0) %，與對照18599無顯著差異(84.0 ±2.0) %(P> 0.05)，二者出苗期均為(16.0±0 ) d；T抗-4的抽雄期、散粉期和吐絲期分別為(78.0±0 )、(81.0±0 ) 和(83.0±0) d，均顯著短于對照18599(P< 0.05)，但二者完熟期相差不足1 d，且無顯著差異(P> 0.05，表2)。

田間表型性狀T抗-4具有白色根、紫紅色芽鞘、紫紅色花藥、紅色花絲、披散株型，這些性狀與對照18599相同；T抗-4在完熟期共有(14.5±0.0) 個葉片，18599有(15.1±0.2) 個葉片，二者無顯著差異(P>0.05)；T抗-4株高為(154.6±1.5) cm，與18599株高無顯著差異(P>0.05)；穗位方面，T抗-4為(46.7±2.2) cm，18599為(58.4±1.5) cm，二者差異也不顯著(P>0.05，表3)。

產量性狀方面，T抗-4具有錐型穗、硬粒型、黃粒色和白色軸，這些都與18599一致。T抗-4和18599在穗長、突尖、穗粗、穗行數、行粒數、百粒重和產量方面均無顯著差異(P> 0.05)，但T抗-4軸重顯著低于對照18599(P< 0.05)，二者分別為 (19.9±0.2) 和(30.2±0.5) g(表4)。

以上數據表明，轉化體T抗-4與轉化受體18599相比，在主要農藝性狀表現上基本無差異。

2.2 玉米轉化體T抗-4對非靶標除草劑的耐受性

2.2.1 非靶標除草劑噴施1周后的田間表現 噴施1和2倍推薦中劑量的非選擇性、滅生性除草劑草銨膦1周后，轉化體T抗-4及其非轉基因對照18599，以及田間雜草均100 %干枯、死亡(圖4A)。說明在農業生產中，耐草甘膦性狀的轉基因玉米T抗-4可以通過常規的玉米敏感除草劑和非選擇性除草劑草銨膦進行防治和殺滅，保障了轉化體的環境安全。

表4 T抗-4產量及考種性狀調查

注：同列數據采用LSD法檢驗差異顯著性(α=0.05)。

Note： LSD method was used to test the significance of the same column of data (α=0.05).

噴施1 和2倍推薦中劑量的玉米敏感除草劑精喹禾靈1周后，轉化體T抗-4及其非轉基因對照18599均表現嚴重的藥害癥狀，藥害等級為4～5級，藥害率為100 %(圖4B)；但對田間雜草——空心蓮子草沒有影響。說明玉米敏感的除草劑，部分雜草不一定敏感。

噴施1和2倍推薦中劑量的玉米常用除草劑硝磺草酮-莠去津混劑和煙嘧磺隆1周后，轉基因玉米T抗-4和非轉基因對照18599均生長正常，無藥害，與清水對照一致，但雜草開始枯黃(圖4C、圖4D)。

2.2.2 非靶標除草劑噴施2周后的田間表現 噴施1和2倍推薦中劑量的非選擇性、滅生性除草劑草銨膦2周后，轉化體T抗-4及其非轉基因對照18599，以及田間雜草均100 %干枯、死亡(圖5A)。噴施1和2倍推薦中劑量的玉米敏感除草劑精喹禾靈2周后，轉化體及其非轉基因對照18599均100 %死亡(圖5B)；但對田間雜草——空心蓮子草影響不大。噴施1和2倍推薦中劑量的玉米常用除草劑硝磺草酮-莠去津混劑和煙嘧磺隆2周后，轉基因玉米T抗-4和非轉基因對照18599均生長正常，無藥害，與清水對照一致，但雜草開始枯死(圖5C、圖5D)。說明玉米常用除草劑硝磺草酮-莠去津混劑和煙嘧磺隆是較好玉米地的選擇性除草劑。

2.2.3 非靶標除草劑噴施4周后的田間表現 非靶標除草劑噴施4周后的整體田間表現見圖6A。噴施1 和2倍推薦中劑量的非選擇性、滅生性除草劑草銨膦4周后，轉化體T抗-4及其非轉基因對照18599，以及田間雜草均100 %干枯、死亡(圖6B)。

噴施1和2倍推薦中劑量的玉米敏感除草劑精喹禾靈4周后，轉化體及其非轉基因對照18599均100 %死亡(圖6C)；但對田間雜草——空心蓮子草影響不大，其余雜草死亡。

A：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施草銨膦1周；B：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施精喹禾靈1周；C：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施硝磺草酮-莠去津1周；D：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施煙嘧磺隆1周圖4 非靶標除草劑噴施1周后的田間表現Fig.4 Field performance after 1 week of non-target herbicide application

A：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施草銨膦2周；B：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施精喹禾靈2周；C：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施硝磺草酮-莠去津2周；D：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施煙嘧磺隆2周圖5 非靶標除草劑噴施2周后的田間表現Fig.5 Field performance after 2 week of non-target herbicide application

A：非靶標除草劑試驗的整體田間表現；B：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施1和2倍草銨膦4周；C：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施1和2倍精喹禾靈4周；D：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施1倍硝磺草酮-莠去津4周；E：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施2倍硝磺草酮-莠去津4周；F：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施1倍煙嘧磺隆4周；G：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施2倍煙嘧磺隆4周；H：轉化體T抗-4和非轉基因對照18599噴施清水4周后的田間表現圖6 非靶標除草劑噴施4周后的田間表現Fig.6 Field performance after 4 week of non-target herbicide application

噴施1和2倍推薦中劑量的玉米常用除草劑硝磺草酮-莠去津混劑和煙嘧磺隆4周后，轉基因玉米T抗-4和非轉基因對照18599均生長正常，無藥害，與清水對照一致，但雜草完全枯死(圖6D-G)。說明玉米常用除草劑硝磺草酮-莠去津混劑和煙嘧磺隆是較好玉米地的選擇性除草劑，且使用1倍的濃度就可以了。

噴施清水作為對照處理表明：轉基因玉米T抗-4和非轉基因對照18599均生長正常，但雜草也正常生長(圖6H)。

2.2.4 不同非靶標除草劑不同噴施濃度對株高的影響 為了更細致的評價2種玉米常用除草劑對轉化體和受體對照生長的影響，對各處理下的玉米株高進行了調查，如表5所示，在0，1和2倍處理1周后，2周后和4周后，轉化體T抗-4及其非轉基因對照18599的株高無顯著差異；不同濃度處理之間的株高也無顯著差異。說明適用玉米除草劑并未抑制植株的正常生長。轉化體和非轉基因對照除了在目標性狀草甘膦抗性方面具有顯著差異之外，對非靶標除草劑莠去津和煙嘧磺隆的耐性表現具有等同性。

表5 T抗-4和18599在不同非靶標除草劑噴施濃度條件下的株高

續表5 Continued table 5

材料Materials除草劑及濃度Herbicides and concentrations調查時間Investigation time株高(cm)Plant heightP 值P value185991×莠去津噴施后2周47.4±1.7 a185992×莠去津噴施后2周44.1±1.2 aT抗-41×煙嘧磺隆噴施后2周54.7±8.6 a0.25T抗-42×煙嘧磺隆噴施后2周55.5±9.2 a185991×煙嘧磺隆噴施后2周45.5±5.2 a185992×煙嘧磺隆噴施后2周46.1±4.7 aT抗-41×莠去津噴施后4周112.5±9.6 a0.31T抗-42×莠去津噴施后4周112.3±10.8 a185991×莠去津噴施后4周105.2±6.1 a185992×莠去津噴施后4周100.5±6.5 aT抗-41×煙嘧磺隆噴施后4周114.5±15.2 a0.40T抗-42×煙嘧磺隆噴施后4周111.3±14.6 a185991×煙嘧磺隆噴施后4周96.8±9.4 a185992×煙嘧磺隆噴施后4周102.0±13.9 a

注：數值以3次生物學重復的平均值±標準差表示，同列小寫字母相同表示相同地點相同材料不同噴施劑量之間經LSD法檢驗差異不顯著(P> 0.05)。

Note: The values were expressed by the mean ± standard deviation of three biological repeats, and the same small letters in the same column indicated that the difference between different spraying doses of the same material in the same place was not significant by LSD (P> 0.05).

3 結論與討論

我國把食物安全、生態安全、綠色發展等作為重大需求，對產業發展有帶動作用的目標性狀突出、綜合性狀優良的新型轉基因動植物品系是當前重點研發導向。隨著轉基因技術的不斷發展，尤其是基因RNA干擾技術、合成生物學、編輯技術等生物育種新技術的出現，正是轉基因作物安全評價進一步發展和完善的良好時機。轉基因作物的安全評價為轉基因新品種產業化提供科學支撐。

目前，草甘膦抗性的雜草和Bt蛋白抗性的害蟲已有報道[11-12]。本試驗分別選取常規玉米田間普遍施用的除草劑(硝磺草酮-莠去津和煙嘧磺隆)、常規玉米敏感的選擇性除草劑(精喹禾靈)以及非選擇性除草劑(草銨膦)，作為非靶標除草劑的研究對象，通過人工噴施1和2倍的田間推薦劑量，評價轉化體對非靶標除草劑的耐受性。結果表明：上述非靶標除草劑對受體植株18599和玉米轉化體T抗-4的影響是一致的。這一方面說明，轉化體和受體對照雖然對靶標除草劑草甘膦的耐受性方面存在顯著差異，但是對非靶標除草劑的耐性表現具有等同性；另一方面說明，未來的商業化生產過程中，耐草甘膦性狀的轉基因玉米T抗-4可以通過常規的玉米敏感除草劑和非選擇性除草劑草銨膦進行防治和殺滅，轉基因玉米田也可應用常規玉米田除草劑進行除草，這為轉基因玉米的人工控制、自生苗防除以及抗性雜草出現后的雜草治理提供了可用的措施，進一步保證了轉化體的環境安全性。轉化體T抗-4的綜合農藝性狀評價表明在植物形態學上表現上與轉化受體18599基本無差異，為進一步評價轉化體的生存競爭能力提供基礎資料。

轉基因玉米作為生物技術產業化重大成果，已在世界各地普遍應用，不遠的將來，轉基因玉米在我國的產業化應用也將是大勢所趨，為此，應在技術上尤其是安全評價方面做好充分的準備。將進一步完成高抗草甘膦轉基因玉米T抗-4環境安全性評價的其他部分試驗以及食用性安全評價等。