油棕花粉形態的觀測及花粉萌發相關基因的表達研究

李元元，楊蒙迪，曹紅星，李新國*

(1.中國熱帶農業科學院椰子研究所，海南 文昌 571339；2.海南大學熱帶農林學院, 海南 海口 570228)

【研究意義】油棕(ElaeisguineensisJacq.)屬棕櫚科多年生的熱帶木本油料作物，每公頃產油量高達6～8 t，被稱為“世界油王”[1]。根據其果實的結構和含油量不同，油棕分為厚殼種Dura，無殼種Pisifera和薄殼種Tenera三類[2]。不同植物種類的花粉在長期的進化過程中，經過不斷演化和發展往往形成獨特的形態特征[3-4]。植物的花粉作為較為保守的繁殖器官的一部分，其結構由物種的基因所決定，受環境影響很小[5-6]，其形態特征具有很強的遺傳性，是研究植物演化和分類的重要依據之一[7]。花粉大小、形狀、對稱性和極性，花粉萌發孔的數量、結構和位置，花粉壁的結構以及表面雕紋等，可為植物系統發育的研究提供科學依據[8]。電子顯微鏡能夠對微觀特征包括花粉萌發孔和溝的位置、數目以及外壁結構、雕紋式樣等方面的細微差異進行觀察，從而為某些疑難類群的分類劃界和系統定位提供了頗有價值的信息[9]。【前人研究進展】目前，利用SEM觀察植物花粉形態的研究已有很多，如“黃金蜜柚”[10]、薄殼山核桃[11]、獼猴桃[12]、油茶[13-14]、大戟科不同屬不同種植物[15]等。20世紀80年代，已有學者對國產棕櫚科的花粉形態進行研究[16]。但對油棕花粉微觀形態結構的研究少見報道。MYB(myeloblastosis)蛋白在植物生理代謝和發育過程中廣泛地參與調節[17-18]。AtMYB125/DUO1是一個控制雄性生殖細胞分裂和分化的花粉特異因子[19]。GPI的生物合成也是花粉萌發和花粉管生長所必需的[20]。但在油棕的花粉萌發過程中有關MYB及GPI等相關基因的研究還少見報道。【本研究切入點】本研究通過對3種類型油棕花粉形態的掃描電鏡觀察及對花粉萌發前后相關基因的表達分析。【擬解決的關鍵問題】可以為油棕的品種鑒定、系統分類和從分子水平上揭示了花粉萌發的調控機制等奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗的油棕花粉來源于海南省文昌市的中國熱帶農業科學院椰子研究所油棕資源圃內的厚殼種Dura、薄殼種Tenera和無殼種Pisifera等3種。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉采集及SEM觀察 2017年9-10月，采摘3種果殼類型的油棕雄花序并在采摘當天帶回實驗室，輕輕將花粉抖落在鋪有硫酸紙的實驗臺上，再將花粉進行過篩處理，篩孔徑為0.1 mm。將過篩處理后的花粉在38 ℃烘箱中干燥36 h，隨后花粉用干燥好的離心管等密封容器盛放保存在-20 ℃冰箱內備用[21]。

將干燥后的供試花粉粒分別用牙簽均勻彈在黏有雙面導電膠的金屬載臺上，放入SBC-12型離子濺射儀中噴金，然后置于德國ZEISS掃描電子顯微鏡下觀察，選取典型的花粉粒進行拍照。用CAD軟件測量花粉粒大小，每種花粉粒測量10粒，求平均值，并計算標準差。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成 利用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒進行總RNA的提取。采用Takara試劑盒，將mRNA反轉錄合成cDNA第1條鏈。

1.2.3 qRT-PCR 本研究運用實時熒光定量PCR技術測定一些基因在3種果殼類型油棕花粉萌發前后及授粉后不同時間點的油棕雌花中的相對表達量，選擇穩定性較好的看家基因Actin作為內參基因(表1)。

以上引物均委托廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。

10 μl反應體系含有5.0 μl SYBR?Select Master Mix、0.5 μl Primer(F)、0.5 μl Primer(R)、1.0 μl(100 ng/μl)cDNA、3.0 μl ddH2O。

1.3 數據分析

應用SAS(Statistical Analysis System)軟件對實驗數據進行統計分析， 采用鄧肯氏新復極差檢驗法進行多重比較，在α=0.01水平進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 花粉的外部形態特征

2.1.1 大小與形態結構 由圖1～3可知，3種類型的油棕花粉形態非常相似，均以單粒形式存在，形狀為邊緣光滑的近正三角形。厚殼種花粉的平均邊長為32.86 μm，薄殼種的為32.51 μm，無殼種的為33.87 μm，差異不顯著(表2)。

2.1.2 外壁紋飾與萌發孔溝 3種果殼類型的油棕花粉外壁均具網脊，屬于細網狀紋飾，網眼成淺穴狀或兼具不規則小穿孔，萌發孔周圍的網狀紋飾較稀疏。具3條大致沿正三角形3個頂角的角平分線方向分布的孔溝。由圖1～3可以看出，薄殼種花粉形態與厚殼種和無殼種的不同，薄殼種背部網紋較平滑，而厚殼種和無殼種的凸起。

表1 所測引物及序列

圖1 厚殼種Dura花粉形態Fig.1 Pollen morphology of Dura

圖2 薄殼種Tenera花粉形態Fig.2 Pollen morphology of Tenera

圖3 無殼種Pisifera花粉形態Fig.3 Pollen morphology of Pisifera

2.2 花粉萌發前后的qRT-PCR檢測

不同果殼類型的油棕花粉萌發前后qRT-PCR檢測結果如圖4～6所示，同種基因在不同果殼類型的油棕花粉中表達情況不同，GPI-anchored基因在3種果殼類型的花粉中均有表達，且萌發3 h后表達量均下降，即該基因為下調表達，但下降幅度不同。MYB基因在萌發前的3種果殼類型花粉中均有表達，但萌發3 h后卻只在厚殼種花粉中檢測到表達，且為下調表達。MYB(x3)基因在萌發前后的3種果殼類型油棕花粉中均檢測到表達，但表達情況不同，厚殼種中萌發前后表達量相同，薄殼種中為下調表達，無殼種中為上調表達。

表2 3種果殼類型的油棕花粉大小

圖4 GPI-anchored基因在3種果殼類型油棕的萌發前后花粉中的表達情況Fig.4 Relative expression of GPI-anchored gene in pollen grains of 3 different types of oil palm before and after germination

圖5 MYB基因在3種果殼類型油棕的萌發前后花粉中的表達情況Fig.5 Relative expression of MYB gene in pollen grains of 3 different types of oil palm before and after germination

3 討 論

孢粉學是研究植物的孢子、花粉(簡稱孢粉)的形態、分類及其在各個領域中應用的一門科學，它作為植物進化中古老的學科，在揭示物種進化上能提供穩定、有效的證據[22]。花粉的形態特征不受外界條件影響，而受植物基因型控制，具有固定的形態結構，是探討植物起源、演化及親緣關系的重要特征之一[23]。為植物的系統分類與親緣關系鑒定等方面提供了重要依據[24]。

然而，在利用掃描電鏡觀察花粉形態特征的試驗中，樣品制取方法卻不盡相同。原則上，我們要求試驗材料保持其本來面目，故理論上用新鮮花粉直接觀察最好，但采集新鮮花粉直接觀察，在人力和物力上也存在困難；因而，在采用電鏡進行花粉觀察之前，必須選擇適當的方法將花粉加以保存，分批采樣、集中保存、集中觀察[25]。Priambodo等研究了3種類型的油棕花粉形態和蛋白質特性[26]，認為油棕花粉形態為近似三角形。本試驗發現3種果殼類型的花粉粒均以單粒形式存在且其形態相似，均為邊緣光滑的近正三角形，邊長在29.70～37.68 μm之間，具3條萌發孔溝，外壁紋飾均為細網紋狀，萌發器官形態較為一致，充分反映了油棕物種的自然屬性。

圖6 MYB(x3)基因在3種果殼類型油棕的萌發前后花粉中的表達情況Fig.6 Relative expression of MYB (x3) gene in pollen grains of 3 different types of oil palm before and after germination

qRT-PCR技術是一種很好的檢測基因表達的方法，通過該技術可以分析植物在不同處理條件下基因樣本的表達差異，也可以分析植物在不同生長發育時期基因表達的差異[27]。趙和文等運用qRT-PCR技術，通過觀察與褐化相關基因PPO和PAL在組織培養過程中不同時期的表達量及蝴蝶蘭組培苗培養不同階段中2個基因的表達差異研究，得出2個基因在培養的第12天表達量都達到最高，說明此時是褐化發生的關鍵時期，若此時期對其進行有效預防措施，將會減少褐化現象[28]。劉霞宇等運用qRT-PCR研究出金銀花花器官基因表達時可選用的內參基因[29]。本研究發現同種基因在不同果殼類型中的表達情況是不同的，變化趨勢有的也不一致，也許是不同類型間的差異所致，也可能是因天氣或取樣情況的不同引起的。同種基因在不同果殼類型油棕的萌發前后花粉和授粉前后雌花中的表達情況不同，可知該基因在不同果殼類型的油棕中具有不同的作用。GPI-anchored在3種果殼類型萌發前后的油棕花粉中均有表達，且萌發后于萌發前為下調表達；MYB在萌發前的3種類型的花粉中均表達，但萌發后僅厚殼種中有表達。MYB(x3)在3種果殼類型萌發前后的油棕花粉中均有表達，厚殼種中萌發前后相對表達量相同，薄殼種中萌發后于萌發前為下調表達，無殼種中萌發后于萌發前為下調表達。

4 結 論

本研究用于掃描電鏡觀察的花粉僅進行了干燥處理，未用其他化學藥品進行處理，用于測量大小的花粉個數偏少。對萌發前后基因的表達情況也是通過查閱別人在其他作物上報道的基因，在油棕中通過BLAST比對獲得，因此對以上幾個基因在花粉萌發前后的作用仍需進一步研究。