基于光合菌劑的復合微生物菌肥對土壤速效養分含量及微生物群落結構多樣性的影響

涂保華，符 菁，趙 遠，趙利華，肖 嫻，張 晟*，衛國華，吉昕華

(1.常州大學環境與安全工程學院，江蘇 常州 213164；2.新疆光合元生物科技有限公司，新疆 昌吉 831100)

【研究意義】水稻是我國主要的糧食經濟作物，對提高我國經濟水平具有十分重要的作用[1]。保障食品安全、避免環境污染也已成為我國農業科研所關注的熱點。為了增加水稻產量，人們擴大了化肥、化學壯秧劑和農藥等農用化學品的生產和使用。土壤的肥力與作物的生長息息相關，由于過度依賴于農用化學品，致使土壤的肥力下降，破壞土壤原有結構，使農作物產量遭受不同程度的減產，影響土壤的可持續利用[2-5]。光合細菌(Photosynthetic Bacteria,簡稱PSB)是地球上最早被發現并廣泛存在的具有原始光能合成體系的原核生物，擁有固定氮碳的能力。復合微生物菌肥(Compound biofertilizer)是由動物糞便經酸化處理后進入發酵罐，在大量厭氧菌發酵分解制成原液后，添加自行培養且具有獨特生態生理學特性的光合菌和芽孢桿菌等有益微生物以及作物生長所需要的有機質、多種微量元素等制成；其作用是集營養、抑制病蟲害、調節植物生長和降解土壤污染物于一體[6]，富含植物生長所必須的多種營養元素、維生素和生物硒等多種調節植物新陳代謝的活性物質。復合微生物菌肥因其具有用量少、成本低、本身安全無公害、不污染環境、資源循環利用等優點，逐步成為我國發展高效生態農業，生產綠色有機產品的首選肥料。【前人研究進展】田曉亮等[7]實驗結果表明，復合微生物肥料在鹽堿地的施用，不僅有效地提高了植物的成活率與保存率，土壤的含水量及有機質含量，而且能夠改善鹽堿地土壤pH值。庫永麗等[8]研究表明，微生物肥料施用于獼猴桃幼苗能夠顯著提高土壤肥力(速效氮、磷、鉀等)，能夠平衡土壤微生物群落結構，對果園土壤的改良及果實品質的影響效果明顯。葛芙蓉等[9]研究表明，復合微生物肥施用于大棚番茄“上海908”，結果顯示復合微生物肥可以明顯促進番茄植株的生長，提高其產量、品質。Dozet G等[10]研究表明，微生物生態生產技術與常規種植技術相較，施用微生物肥料后，莢果數與籽粒數、單株粒重與產量呈極顯著正相關，有效提高大豆的產量。王延軍等[11]試驗表明，在有機栽培體系下，微生物肥料配合有機肥施用有利于改善土壤的理化性質，微生物肥料可明顯改善水稻產量，具有較好的增產作用。【本研究切入點】在盆栽試驗條件下，本試驗通過將化肥、光合菌劑配施化肥和復合微生物菌肥分別作為肥料施入到土壤中，研究不同處理對水稻產量、產量性狀以及土壤養分的影響，在不施加化肥的條件下，單施復合微生物菌肥的作用效果優于化肥及光合菌劑配施化肥處理，以此發揮復合微生物菌肥在水稻生長各時期中的最佳促生長作用。【擬解決的關鍵問題】為今后應用于田間試驗提供參考價值，同時為復合微生物菌肥在農業生產、水產上以及發展新型高效肥料等推廣應用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

盆栽試驗于2017年6月29日至11月6日在江蘇省常州大學進行，屬于亞熱帶季風氣候，年平均降水量1084 mm，年平均溫度16.0 ℃，陽光日照數1943 h，供試土壤為水稻土，取自鎮江丹陽水稻田，每盆盆底面積為0.07 m2，底部密封，防止漏水漏肥。供試土壤基本理化性質見表1。

1.2 供試材料

以水稻作為研究對象，水稻種子購自農技站，供試水稻品種為南粳5055號；每盆裝入風干土6 kg，栽種3穴，每穴2株。供試肥料為新疆光合元生物科技有限公司生產的復合微生物菌肥和光合細菌菌劑，主要技術指標均為有效活菌數≥2.0億個/mL，使用時按比例用水稀釋。氮肥為顆粒狀尿素，含N 46 %；磷肥為粉末狀過磷酸鈣，P2O5含量12 %；鉀肥為粉末狀紅色氯化鉀，K2O含量60 %。雞糞購自新疆某養殖場。復合微生物菌肥主要成分配比為：雞糞發酵液35 %，光合菌(Photosynthetic bacteria)15 %，芽孢菌(Bacillus)8 %，N+P2O5+K2O總養分10 %等。

1.3 試驗設計

盆栽試驗共設置3個處理，分別為化肥(CK)、光合菌劑配施化肥(P1)、復合微生物菌肥(P2)，每個處理3個重復，共9盆，盡量維持水量為田間持水量的60 %，各處理放置在室外自然光下生長。P1、P2處理菌劑施用量均為24 g/m2，CK處理施加等量蒸餾水，分別在水稻分蘗期根灌一次，在抽穗期時噴施一次。各處理以每盆施入P2O51.71 g、K2O 0.5 g作為基肥；追肥分別在水稻分蘗期和抽穗期，CK、P1處理追施尿素9.43 g/m2，P2處理不作其他肥施入。管理方式完全按水稻常規生產技術措施標準統一執行，每盆采用單排單灌。

表1 供試土壤基本理化性質

1.4 測定項目及分析方法

(1)采樣及處理：水稻生長每個時期(返青期、分蘗期、曬田期、抽穗期、開花結實期、收割期)，按五點法進行采樣，將土壤混合約300 g 裝入自封袋，帶回實驗室自然風干，取風干土經研磨過20目篩后裝入自封袋測其土壤養分；在水稻收割期每盆各選取3株進行水稻產量及產量性狀調查。

(2)分析方法[12-13]：堿解氮含量的測定采用堿解擴散法；速效磷含量的測定采用0.5 mol/L碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法；土壤有機質采用重鉻酸鉀法測定。水稻產量及產量性狀調查：調查平均株穗數、株高、穗長；每穗粒數、結實率和千粒重，待稻谷風干后脫粒測其產量[14]。

土壤微生物DNA提取：將保存于-80 ℃冰箱的土壤取出，稱取2 g 土用液氮研磨后，采用試劑盒方法提取土壤DNA，提取后的DNA樣品在-80 ℃冰箱下低溫保存。

(3)數據統計：試驗數據采用Excel2016進行處理，利用SPSS 16.0 軟件進行數據統計及差異顯著性分析(P<0.05)，利用0rigin8.5對數據進行繪圖，用 R 3.1.5軟件計算高通量測序多樣性指數，包括多樣性指數(Shannon index)和豐富度指數(Chao1 index 和ACE index)等。

同一采樣時間不同處理的柱子上，有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著；不同小寫字母之間表示差異顯著(Duncan’s法，P<0.05，n =3)，下同圖1 復合微生物菌肥對土壤速效磷含量的影響Fig.1 Effect of compound microbial fertilizer on the content of soil available phosphorus

2 結果與分析

2.1 復合微生物菌肥對土壤速效磷含量的影響

如圖1所示，返青期時，3個處理中土壤的速效磷含量都很高，施加復合微生物菌肥使土壤速效磷含量顯著高于化肥處理12.47 %。分蘗期時，復合微生物菌肥處理顯著增加土壤速效磷含量，與施加光合菌劑配施化肥及化肥處理相比，分別高43.43 % 和9.75 %，在同一時期，化肥處理會導致速效磷在土壤中大量累積，而施加光合菌劑配施化肥處理的土壤速效磷含量則與返青期時無顯著差異。抽穗期時，光合菌配施化肥處理的土壤速效磷含量顯著高于化肥處理7.88 %，這可能是由于水稻曬田期間調節土壤養分對水稻生長過程起到先控后促的作用，而光合細菌是一種多功能的益生菌[15]，可提高土壤中微生物數量進而使土壤迅速肥沃起來，由此提高肥效利用率。綜上，除了在水稻個別生長時期，復合微生物菌肥提高土壤速效磷含量效果是大大優于化肥，在分蘗期施加復合微生物菌肥效果最佳，也可說明此時酶活性很強。

2.2 復合微生物菌肥對土壤堿解氮含量的影響

如圖2所示，縱觀水稻生長周期，復合微生物菌肥處理的土壤堿解氮含量呈現先降低后緩慢上升的趨勢，除抽穗期外，復合微生物菌肥處理的土壤堿解氮含量顯著高于化肥處理，其范圍為12.06 %～27.27 %。在返青期時，復合微生物菌肥處理的土壤堿解氮含量達到峰值并顯著高于光合菌劑配施化肥、化肥處理，分別高出18.75 %和23.91 %。收割期時，復合微生物菌肥處理的土壤堿解氮含量顯著高于光合菌劑配施化肥、化肥處理，分別高出15.81 %和18.25 %。綜上所述，復合微生物菌肥能夠大大提高土壤堿解氮含量，而且處理效果優于光合菌劑配施化肥、化肥處理。

2.3 復合微生物菌肥對土壤有機質含量的影響

土壤有機質是植物營養的主要來源之一，能夠促進植物的生長發育，改善土壤的理化性狀，促進土壤微生物活動，是土壤微生物生長代謝所需的C源和N源，提高土壤的保肥性和緩沖性的作用，有機質的含量與土壤肥力水平密切相關[16-17]。如圖3所示，施加復合微生物菌肥處理的土壤有機質含量有不同程度的增加，返青期時，復合微生物菌肥處理的土壤有機質含量顯著高于化肥處理(P< 0.05)。分蘗期時，復合微生物菌肥處理和光合菌劑配施化肥處理的土壤有機質含量顯著高于化肥處理10.97 %和16.85 %。曬田期，復合微生物菌肥處理的土壤有機質含量達到峰值，與光合菌劑配施化肥、化肥處理的有機質含量相比并不顯著。從整個水稻生長看來，除了曬田和收割2個時期，復合微生物菌肥處理的土壤有機質含量顯著高于化肥處理(P<0.05)。綜上，復合微生物菌肥能夠大大提高土壤有機質含量，有利于土壤有機質的積累，而且處理效果優于光合菌劑配施化肥、化肥處理。

2.4 復合微生物菌肥對水稻產量及性狀的影響

由表2所示，水稻的產量與每平方米穗數、每穗粒數、結實率及粒重(千粒重)4個因素密切相關[18-19]。各處理均能使水稻增產，這源于微生物活動可使土壤疏松，從而提高了土壤的通透性，改善了土壤結構；與化肥處理相比，復合微生物菌肥處理和光合菌劑配施化肥處理的產量分別提高57.26 %和13.54 %。

圖3 復合微生物菌肥對土壤有機質含量的影響Fig.3 Effect of compound microbial fertilizer on soil organic matter content

從水稻性狀可看出，與化肥處理相比，復合微生物菌肥處理和光合菌劑配施化肥處理使水稻的穗長、有效穗數、每穗粒數、實粒數和千粒重都有所增加，其中，每穗粒數分別提高了34.29 %和3.81 %，實粒數分別提高了37.11 %和4.12 %，但結實率沒有明顯的變化。光合菌劑在水稻抽穗期后進行葉面噴施，可以增加水稻的穗粒數，促進水稻生長，降低空癟率和提高水稻產量[20-21]，本實驗所使用的光合菌劑提高了有效穗數、每穗粒數和實粒數，由此可彌補因結實率和千粒重下降所造成的產量損失。復合微生物菌肥可滿足氮磷鉀養分對水稻生長的補給，提高肥料利用率，促進土壤有機質的分解與轉化，在分蘗期施用復合微生物菌肥，可以產生多種對作物有益的代謝產物，這些代謝產物可調節和控制作物生長，對水稻分蘗效果顯著，進而達到增產目的。通過實驗可以看出，施用本試驗的復合微生物菌肥即能夠減少肥料的用量，又能獲得高于化肥的增產效果，復合微生物菌肥處理對水稻增產效果優于光合菌劑配施化肥處理。

2.5 土壤養分對水稻產量性狀的潛在影響

由表3所示，通過IBM SPSS Statistics 22.0 軟件分析各指標之間的雙變量相關性，分析經過添加不同的微生物菌劑處理后，土壤養分與水稻產量性狀之間以及水稻產量性狀之間的變化關系。

土壤養分與水稻產量性狀的Pearson相關性分析結果表明：堿解氮與每穗粒數、實粒數、產量具有極顯著的正相關關系(P<0.01)；株高與速效磷、堿解氮呈較弱的負相關(P>0.05)；對水稻產量性狀之間進行相關性分析：每穗粒數與實粒數、產量，實粒數與產量均呈現極顯著性正相關關系(P<0.01)。

表2 復合微生物菌肥對水稻產量及性狀的影響

表3 土壤養分與水稻產量性狀Pearson相關性分析

注：P值表示顯著性(雙側)。在置信度(雙測)為 0.05 時，相關性是顯著的P*<0.05；在置信度(雙測)為 0.01 時，相關性是極顯著的P**<0.01。

2.6 不同處理對土壤細菌群落結構的影響

由圖4顯示，通過對土壤樣本進行細菌16SrDNA高通量測序分析，為了更好地理解施加不同的微生物菌劑處理后對細菌群落產生的影響；不同微生物菌劑施入土壤，從門級別對土壤細菌類群相對豐度進行分析。變形菌門(Proteobacteria)在所有樣品中處于優勢菌群門，在各處理中其變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria)、藍藻細菌(Cyanobacteria)、浮霉菌(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)等這些門類相對豐度所占比例較高，還有其它相對豐度較低的細菌門。

從門水平上分，在復合微生物菌肥處理中，與化肥處理相比，變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度增加了6.84 %，且各處理間無顯著差異(P>0.05)；復合微生物菌肥和光合菌劑配施化肥處理的酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度比化肥處理分別提高了21.28 %和42.78 %(P> 0.05)，其放線菌(Actinobacteria)的相對豐度也分別提高了24.47 %和32.44 %，而浮霉菌(Planctomycetes)的相對豐度分別提高了33.34 %和31.47 %；綜上所述，各處理間門類相對豐度的變化均不顯著。

圖4 門類級別下各處理的土壤細菌類群相對豐度Fig.4 Relative abundance of soil bacterial groups in different treatments at the phylum levels

圖5 土壤細菌群落的α多樣性Fig.5 Soil bacterial community diversity

2.7 土壤細菌群落的α-多樣性

由圖5所示，在化肥、光合菌劑配施化肥和復合微生物菌肥處理中，每個樣本的OUT數量分別為5304、5288和5126；通過觀察菌群的豐富度和多樣性，不同處理之間Chao1指數和ACE指數無顯著差異(P>0.05)；Shannon 指數無顯著差異(P>0.05)。說明復合微生物菌肥會降低細菌的物種數目，其群落多樣性低，因此，施入不同微生物菌肥對土壤細菌群落結構多樣性的影響也有所不同。

3 討 論

土壤養分是土壤肥力的內部表征[22-23]，與土壤質量關系密切，施用復合微生物菌肥能夠改良土壤結構，改善土壤理化性狀、微生物酶活性和微生物環境[24-26]。在本實驗中，施用復合微生物菌肥可活化土壤營養成分，顯著提高了土壤速效磷、堿解氮和有機質含量，促進水稻生長發育的作用。在水稻返青期、分蘗期和開花結實期，施用復合微生物菌肥與化肥相比可顯著提高土壤速效磷含量，水稻收割期后并無顯著影響。

土壤中有益微生物數量迅速增加可加快土壤中有機質的分解和養分的供應能力[27]。在農業生產中，化肥能夠使作物增產，隨著化肥用量的不斷增加則會導致肥料利用率降低，其中在土壤中大部分肥料會被累積或淋洗而不被作物吸收和利用[28]，引起土壤酸化，使土壤營養成分流失并破壞了土壤肥力結構，造成生態環境污染。本實驗中，與化肥處理相比，光合菌劑配施化肥處理的土壤養分含量較高，說明光合細菌在土壤中起到一定的作用，但其效果仍低于復合微生物菌肥處理。復合微生物菌肥更能有效提高水稻產量、產量性狀及土壤養分，說明在本實驗追肥處理中，復合微生物菌肥能夠高于光合菌劑配施化肥及施用化肥的效果，對今后能有效替代化肥或減少化肥施用量帶來參考依據。復合微生物菌肥具有無毒無害無污染等優點，對生產出綠色農產品，大力在農業生產鄰域中推廣應用具有良好的發展前景。

水稻產量是由單位面積上的穗數、每穗粒數、實粒數和千粒重四個基本因素所構成，各處理均可促進水稻生長并表現出增產的效果，復合微生物菌肥處理和光合菌劑配施化肥處理均比化肥處理的稻谷產量高。復合微生物菌肥處理與化肥處理相比較，提高了水稻株高、穗長、有效穗數、每穗粒數、實粒數和千粒重。在水稻返青期時，由于底物養分充足，土壤酶活性強，水稻土壤速效磷、銨態氮、堿解氮和有機質含量高；在水稻分蘗期時，土壤養分含量由于再次施用復合微生物菌肥得以提高，所以，在水稻分蘗期施用復合微生物菌肥的處理效果最佳，對土壤養分的增加起到決定性的作用，改善了土壤的理化性狀，促進了水稻的生長，增強了水稻的抗逆性，促進水稻的光合作用，提高了水稻的產量。

通過對門類級別下不同處理間土壤細菌類群相對豐度分析發現，各處理間變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria) 、藍藻細菌(Cyanobacteria)、浮霉菌(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)等這些門類相對豐度的變化均不顯著；我們的結果和聶三安等[29]提到的一致，施肥有利于Proteobacteria、Chloroflexi的富集。對微生物群落結構組成分析進一步發現，單施化肥處理能在一定程度上提高細菌的α多樣性，但并未達到顯著水平，而復合微生物菌肥處理降低細菌的豐富度和多樣性指數，而本研究結果表明復合微生物菌肥處理對土壤細菌多樣性無顯著影響，這可能與土壤本身的特征以及微生物菌有關。

4 結 論

復合微生物菌肥處理能夠促進土壤有效養分的吸收和轉化。本實驗所使用的復合微生物菌肥在不施化肥的條件下能夠增加水稻產量并提高水稻產量性狀，能有效提高土壤養分和土壤肥力，在不同程度上提高水稻土壤速效磷、堿解氮和有機質含量，從而可以滿足水稻在生長發育過程中所需要的養分，能夠協調土壤養分供應與水稻養分需求之間的關系，提高養分利用率，維持土壤肥力，可以增加水稻對磷的吸收積累，提供了養分基礎，對土壤群落結構及多樣性產生一定的影響，對水稻增產有促進作用。由于本研究采用的是盆栽試驗，對于水稻品質相關的結論未能驗證，仍有待進一步在田間上研究驗證。