一株生姜生防內生真菌的生態學特性

劉增亮，汪 茜，宋 娟，周雙云，覃曉娟，車江旅，陳廷速*

(1.廣西農業科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農業科學院園藝研究所，廣西 南寧 530007；3.廣西農業科學院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】生姜(ZingiberofficinaleRosc.)屬多年生草本植物，在亞洲地區多被用作傳統藥物[1]，也是世界范圍內廣泛應用的主要香辛類保健蔬菜[2]。我國生姜栽培歷史久遠，2018年栽培面積達29.9萬hm2[3]，在食品、醫藥和化妝品等多個行業均有應用[4]。隨著生姜種植面積的不斷擴大和種植規?；敛?、莖腐病和斑點病等病害也日益嚴重，經濟損失巨大。目前對這些病害的防治以化學農藥防治為主，大量使用化學藥劑導致環境污染和抗藥性增加，也危害人體健康。內生真菌特別是內生木霉菌是植物病害生防微生物的重要來源[5]，其抑菌機制多樣，生防潛力巨大。因此，探究生姜內生木霉菌株的生態學特性，對該菌株的發酵生產、制劑研制及田間應用于姜瘟病、莖腐病和斑點病等病害防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】內生木霉菌廣泛分布于可可[6]、茶樹[7]、香蕉[8]、蘆薈[9]、蘆竹[10]、銀杏[11]、紅豆杉[12]、板藍根[13]、枸骨[14]、滇牡丹[15]、香榧[16]、楊樹[17]和枇杷[18]等植物根際。王莉衡等[9]研究顯示，庫拉索蘆薈內生哈茨木霉LH-7對9種常見植物病原真菌具有顯著的抑制作用(抑制率為62.4 %～88.4 %)，該菌株的代謝產物含有抑制病原菌生長及孢子萌發的活性物質，可導致病原菌菌絲體生長畸形、細胞壁破裂、產孢結構發育不健全、孢子形成及萌發率降低，從而有效抑制病原菌的生長和繁殖。王國平等[12]研究顯示，用紅豆杉內生木霉菌防治水稻紋枯病，防效達63.82 %，與50 μg/mL井岡霉素A的防治效果相當。楊蕾等[17]從楊樹內生菌中篩選出1株楊樹潰瘍病拮抗真菌YGF9，其對楊樹離體組織潰瘍病防治效果可達76.47 %，是防治楊樹潰瘍病的潛在生防菌株，初步鑒定該菌株為黃綠木霉(Trichodermaaureoviride)。魯海菊等[18]測定分離自黃瓜及枇杷的12株內生木霉菌對枇杷根腐病病菌的抑制效果，結果表明12株內生木霉對枇杷根腐病病菌均有抑制作用，菌株P3.9抑菌率最高，達80.1 %?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于生姜內生木霉菌的研究未見報道；本課題組前期對生姜內生真菌進行了分離篩選，得到一株拮抗生姜莖腐病菌和香蕉枯萎病菌的內生真菌BJM-11，并將其鑒定為綠色木霉(Trichodermaviride)，菌株BJM-11生防潛力巨大，但對其生長和產孢所需溫度、pH、碳源和氮源等影響因子的了解甚少?！緮M解決的關鍵問題】采用菌落生長法和血球計數板孢子計量法，對木霉菌株BJM-11進行詳細的生態學特性分析，明確其生長及產孢條件，為該菌株的發酵生產、制劑研制及田間應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

內生真菌BJM-11分離自從廣西百色采集的生姜健康根系，結合形態學和分子生物學方法鑒定為綠色木霉(Trichodermaviride)，由廣西農業科學院微生物研究所土壤微生物研究室分離保存(保藏編號為CGMCC NO.17196)。

1.2 試驗方法

1.2.1 溫度對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響 將內生真菌BJM-11在PDA平板上25 ℃下培養3 d后，從平板邊緣取4 mm菌餅接種于PDA培養基，然后分別于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃條件下恒溫培養，保持黑暗，48 h后十字交叉測量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數量，每處理5次重復。

1.2.2 pH對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響 將PDA培養基的pH分別調為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0(PDA培養基在pH低于4.0時無法凝固)，將直徑約4.0 mm的BJM-11菌餅接種于上述不同pH的PDA平板中央，25 ℃恒溫培養，保持黑暗，48 h后測量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數量，每處理5次重復。

1.2.3 光照對內生真菌BJM-11菌絲生長和產孢的影響 將接種直徑約4.0 mm BJM-11菌餅的PDA平板分別置于光照條件設定為24 h連續黑暗、24 h連續光照和12 h光暗交替(12 h光照+12 h黑暗)的恒溫培養箱中，25 ℃培養，48 h后測量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數量，每處理5次重復。

1.2.4 碳源對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響 以查氏培養基作為基本培養基，以葡萄糖、木糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖8種供試碳源等量替換(添加量均為3 %)蔗糖配制成含不同碳源的培養基，將直徑約4.0 mm的BJM-11菌餅接種于上述碳源培養基中央，每處理5次重復，25 ℃恒溫培養，保持黑暗，48 h后測量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數量，每處理5次重復。

1.2.5 氮源對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響 以查氏培養基為基本培養基，以鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、尿素、硝酸鉀、胰蛋白胨、甲硫氨酸、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏11種氮源等量替換(添加量均為0.2 %)硝酸鈉配制成含不同氮源的培養基，接種直徑約4.0 mm的BJM-11菌餅，每處理5次重復，25 ℃恒溫培養，保持黑暗，48 h后測量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數量，每處理5次重復。

1.2.6 不同培養基對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響 將直徑約4.0 mm的BJM-11菌餅分別接種到PDA、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)、玉米粉瓊脂(CMA)、查氏和NA 5種培養基上，25 ℃恒溫培養，保持黑暗條件，48 h后測量菌株BJM-11的菌落直徑，7 d后鏡檢孢子數量，每處理5次重復。

1.3 統計分析

試驗數據采用SPSS 20.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響結果

從圖1-A可看出，菌株BJM-11在10～35 ℃范圍內均可生長，在20～30 ℃范圍內菌絲生長較好，在25 ℃時菌絲生長最好，在10和35 ℃條件下菌絲生長緩慢，在5和40 ℃時幾乎無法生長。其中，菌株BJM-11在25和30 ℃時的菌落直徑較大，二者差異不顯著(P>0.05，下同)，但均顯著大于其他溫度處理(P<0.05，下同)。從圖1-B可看出，菌株BJM-11在10～35 ℃溫度范圍內均能產孢，適合產孢的溫度范圍為20～30 ℃，在5和40 ℃時幾乎無法產孢。其中，在溫度為25 ℃時產孢量最大，且顯著大于其他溫度處理，在溫度為30和20 ℃時次之，二者差異不顯著，但均顯著大于其他溫度處理。

綜上所述，25和30 ℃較適宜菌株BJM-11菌絲生長和產孢。

2.2 不同pH對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響結果

從圖2-A可看出，菌株BJM-11在pH 4.0～12.0范圍內均可生長，在pH 4.0～10.0范圍內菌絲生長較好。其中pH為5.0和6.0時的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他pH處理；從圖2-B可看出，菌株BJM-11在pH 4.0～12.0范圍內均可產孢，pH 4.0～10.0范圍內產孢量效果較佳。其中菌株BJM-11在pH為5.0、6.0和7.0時的產孢量較大，三者差異不顯著，但均顯著大于其他pH處理。

綜上所述，pH為5.0和6.0時較適宜菌株BJM-11菌絲生長，pH為5.0、6.0和7.0時較適宜菌株BJM-11產孢。

2.3 不同光照條件對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響結果

從圖3-A可看出，菌株BJM-11在24 h連續光照、24 h連續黑暗和12 h光暗交替條件下均可生長。其中24 h連續黑暗處理的菌落直徑最大，且顯著大于其他光照處理。從圖3-B可看出，菌株BJM-11在24 h連續光照、24 h連續黑暗和12 h光暗交替條件下均可產孢。其中在24 h連續光照條件下產孢量最大，且顯著大于其他光照處理。

綜上所述，24 h連續黑暗較適宜菌株BJM-11菌絲生長，24 h連續光照較適宜菌株BJM-11產孢。

圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～6同Different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05). The same was applied in Fig.2-6圖1 不同溫度對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響Fig.1 Effects of different temperature on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

圖2 不同pH對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響Fig.2 Effects of different pH on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

圖3 不同光照對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響Fig.3 Effects of different light on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

2.4 不同碳源對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響結果

從圖4-A可看出，菌株BJM-11在供試的8種碳源培養基上均能生長，在碳源為葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖時菌絲生長較好，在碳源為木糖時菌絲生長緩慢。其中碳源為葡萄糖和可溶性淀粉時菌落直徑較大，二者差異不顯著，但碳源為葡萄糖處理的菌落直徑顯著大于其他碳源處理；從圖4-B可看出，菌株BJM-11在供試的8種碳源培養基上均能產孢，適合產孢的碳源為葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖。其中碳源為甘露醇時，菌株BJM-11的產孢量最大，且顯著大于其他碳源處理。

綜上所述，以葡萄糖或可溶性淀粉為碳源較適宜菌株BJM-11菌絲生長，以甘露醇為碳源較適宜菌株BJM-11產孢。

圖4 不同碳源對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

圖5 不同氮源對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

2.5 不同氮源對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響結果

從圖5-A可看出，菌株BJM-11在供試的11種氮源培養基上均能生長，在氮源為鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、硝酸鉀、胰蛋白胨、甲硫氨酸、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏時菌絲生長較好，在氮源為尿素時菌絲生長緩慢。其中氮源為酵母浸粉和蛋白胨時，菌株BJM-11的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他氮源處理。從圖5-B可看出，菌株BJM-11在供試的11種氮源培養基上均能產孢，適合產孢的氮源為鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、硝酸鉀、胰蛋白胨、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏，不適合產孢的氮源為尿素和甲硫氨酸。其中氮源為蛋白胨時，菌株BJM-11的產孢量最大，且顯著大于其他氮源處理。

綜上所述，以酵母浸粉或蛋白胨為氮源較適宜菌株BJM-11菌絲生長，以蛋白胨為氮源較適宜菌株BJM-11產孢。

2.6 不同培養基對菌株BJM-11菌絲生長和產孢的影響結果

從圖6-A可看出，菌株BJM-11在PDA、PSA、CMA、查氏和NA 5種培養基上均能生長。其中培養基為PDA和PSA時，菌株BJM-11的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他培養基處理。從圖6-B可看出，菌株BJM-11在PDA、PSA、CMA、查氏和NA 5種培養基上均能產孢。其中培養基為PDA時，菌株BJM-11的產孢量最大，且顯著大于其他培養基處理。

綜上所述，以PDA或PSA為培養基較適宜菌株BJM-11菌絲生長，以PDA為培養基較適宜菌株BJM-11產孢。

3 討 論

內生真菌是定殖于宿主植物組織、但不引起宿主植物產生明顯病變的一類真菌[18]，其在植物體內生長定殖是共同進化選擇的結果，在進化過程中二者形成了互惠共生關系，使內生真菌產生與植物相同或相似的次級代謝產物[18-19]。這些次級代謝產物主要是抗生素類和水解酶類物質，能促進作物生長并抑制病原菌生長[20]。自Stierle等[21]從藥用植物紅豆杉韌皮部分離到1株能產紫杉醇的內生真菌后，學者們才探索將內生真菌尤其是藥用植物內生真菌作為新型藥用活性成分的重要潛在原料[22]，此后對藥用真菌內生真菌的研究應用迅速成為熱點，但針對生姜內生真菌的相關研究僅見Anisha等[23-25]從生姜中分離篩選到3株對生姜莖腐病菌具有明顯拮抗活性內生真菌Rhizopycnisvagum、Paraconiothyriumsp.和Acremoniumsp.及Ginting等[26]從生姜中分離篩選到3株對尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum并分別鑒定為Curvulariaaffinis、Fusariumsolani和Glomerellacingulata的報道。

木霉菌是防治作物土傳病害的重要拮抗真菌，種類繁多，不同種及同種不同菌株在生態學特性等方面存在明顯差異[27-30]。本研究中，菌株BJM-11喜偏酸環境條件，在25～30 ℃及光照條件下其菌絲生長量和產孢量均較大，與劉連妹[31]、紀明山[32]對綠色木霉菌株的研究結果相似。本研究發現，菌株BJM-11的生態學特性也與其他報道[31-32]存在差異，如對溫度的適應范圍較窄，35 ℃時菌絲生長緩慢且完全不能產孢，可能與其宿主生姜生長喜陰涼不耐高溫有關。在利用碳源方面，菌株BJM-11在碳源為葡萄糖時的營養生長較佳，與綠色木霉HT-01[31]和TR-8[32]的特性相似，但菌株BJM-11以甘露醇為碳源時產孢量最大，與綠色木霉HT-01[31]和TR-8[32]產孢的最佳碳源為葡萄糖不一致。在氮源利用方面，菌株BJM-11在氮源為蛋白胨時營養生長和產孢狀況較好，其次為亮氨酸，與綠色木霉TR-8[32]營養生長和產孢的最適氮源為天門冬酰胺、亮氨酸不利于產孢的特性不一致；尿素不利于菌株BJM-11生長和產孢，與綠色木霉TR-8[32]對氮源利用特性一致。綜合分析認為，在發酵培養基中碳源為葡萄糖或可溶性淀粉、氮源為酵母浸粉或蛋白胨時菌株BJM-11菌絲生長速度較快，在碳源為甘露醇、氮源為蛋白胨時菌株BJM-11產孢量較大，可用于指導其發酵生產。

目前關于菌株BJM-11對生姜的促生作用及相互作用的機理還不清楚，有待深入探究。

4 結 論

菌株BJM-11在溫度25～30 ℃、pH 5.0～6.0、連續黑暗及以葡萄糖或可溶性淀粉為碳源、以蛋白胨或酵母浸粉為氮源、培養基為PDA或PSA條件下菌絲生長狀況較佳，在溫度25～30 ℃、pH 5.0～7.0、連續光照及以甘露醇為碳源、以蛋白胨為氮源、培養基為PDA條件下產孢量較大，可供開發利用BJM-11菌株參考。