沉默miR-222上調PUMA基因表達誘導高轉移潛能腺樣囊性癌細胞凋亡*

周子亮 曾秉輝 魏常博 余東升

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)屬于多見的涎腺腫瘤[1]，強侵襲性與早期轉移是其重要特征[2]。目前SACC的標準治療方法是手術切除腫瘤并結合術后放療[3]。然而，術中無法完全切凈的腫瘤細胞以及腫瘤的早期遠處轉移是影響SACC預后的主要原因[4]。微小RNA(MicroRNA，miRNAs)是一類非編碼的單鏈RNA小分子[5]。其中，miR-222是一種具有促癌作用的miRNA。有研究發現在口腔鱗癌等腫瘤細胞中，miR-221和miR-222表達上調，并與腫瘤的生長活性密切相關[6-8]。然而，關于miR-222在轉移性腺樣囊性癌細胞中作用的研究是不充分的。p53上調凋亡調控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)是Bcl-2家族的一員，位于p53的下游，有強大的促凋亡效應[9]。Karst等[10]用免疫組織化學以及組織芯片的方法檢測PUMA的表達，結果提示PUMA的表達抑制與腫瘤發生緊密相關。本文選用涎腺高轉移潛能腺樣囊性癌細胞SACC-LM，著重檢測miR-222與PUMA表達的相關性是否具有特殊性，并觀察細胞遷移、增殖、凋亡等行為的變化，希望發現涎腺轉移性腺樣囊性癌的潛在治療靶點。

1.材料與方法

1.1 主要材料與試劑 DMEM-高糖培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)和青鏈霉素購自美國Hy Clone公司；Opti-MEM培養基、Trizol裂解液及LipfectamineTMRNAiMAX轉染劑(Invitrogen公司，美國)；Trypsin-EDTA溶液(Sigma，美國)；由上海吉瑪公司合成反義miR-222與反義miR-222 NC；PUMA一抗(CST，美國)；抗兔IgG二抗(碧云天，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(生工，中國)。

1.2 細胞培養 在含10%FBS與雙抗(100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)的DMEM-高糖培養基培養SACC-LM細胞。在37℃恒溫孵育箱中，以5%CO2、95%飽和濕度培養，每隔24h更換1次溶液。

1.3 細胞轉染 對數期SACC-LM細胞以1×105個/孔接種在六孔板中，并置于恒溫培養箱中過夜。當匯合度為50%時，用1ml無血清無抗生素培養基替換每個孔溶液。配制終濃度為20μmol/L的反義miR-222培養基 600μl(A液)。于 600μl Opti-MEM 培養基中加入 6μl LipfectamineTMRNAiMAX，混勻并靜置(B液)。10min后，將A、B液混勻，靜置30min。每個孔加入1ml混合液并在37℃放置4h，然后用含有血清的培養基替換。類似地，通過相同的方法將具有FAM熒光標記的As-miR-222 NC轉染到SACC-LM細胞中。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)收集轉染細胞用Trizol裂解，再用DNaseⅠ除去基因組DNA。分別以18Sr RNA與U6 snRNA為PUMA和miR-222的內參設計引物。18Sr RNA引物為5'-CCTGG-ATACC-GCAGC-TAGGA-3'(Forward)，5'-GCGGC-GCAAT-ACGAA-TGCCCC-3'(Reverse)；U6 snRNA引物為5'-CTCGCTTCGG-CAGCA-CA-3'(Forward)，5'-AACG C-TTCAC-GAATT-TGCGT-3'(Reverse)；PUMA引物為5'-GGGCC-CAGAC-TGTGA-ATCC-3'(Forward)，5'-TCACA-CGTGC-TCTCTCTAAA-CC-3'；miR-222引物為5'-ACACTCCAGC-TGGGA-GCTAC-ATCTG-GCTACTG-3'(Forward)，5'-CTCAA-CTGGT-GTCGTGGA-3'(Reverse)。用ΔΔCT法進行數據統計分析。

1.5 蛋白印跡試驗(Western Blot) 將細胞在冰上裂解30min，同時加入PMSF，并取上清以測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后蛋白轉至PVDF膜。將5%脫脂奶粉在37℃下孵育一小時，在4℃下加入一抗過夜，并用二抗在37℃下孵育一小時。用TBST洗膜3次，加入化學發光溶液，并顯影。

1.6 Transw ell遷移實驗 轉染后收集、計數1×105個細胞。在Transwell培養板上室中加入80μl細胞重懸液，并向下室添加500μl有血清的培養基。細胞培養箱中培養12h后，對小室下室側細胞進行固定染色。采用顯微鏡觀察計數，以x±s表示，評估細胞遷移能力。

1.7 CCK-8檢測細胞增殖 轉染48小時后，將細胞以1000個/孔接種在96孔板中，并在每組中設置4個復孔。按時間點(0，24，48，72 h)收集細胞，每孔加入10μl CCK-8溶液。在37℃中放置4h后，用酶標儀讀出OD450的數值并計算，繪畫增殖曲線。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期 基因轉染48h后，向每組收集1×106個細胞，用預冷的PBS洗滌。取0.5ml細胞重懸液，加入Annexin V-FITC 1.25μl，常溫暗室放置15min。離心收集細胞，用預冷的緩沖液重懸，加入10μl碘化丙啶(PI)，冰上避光孵育10min，隨即用流式細胞儀分析凋亡情況。同樣的方法收集與洗滌細胞，加入預冷的70%乙醇4℃過夜固定。離心收集細胞并用PBS洗一次，加入500μl PBS(含50μg/ml碘化丙啶，0.2%Triton X-100，100μg/ml RNase A)，4℃避光放置30 min，隨即用流式細胞儀分析周期分布。

1.9 統計學分析 用SPSS 20.0統計學軟件分析數據。通過兩獨立樣本t檢驗進行樣本的兩兩比較，并通過單因素方差分析比較多組樣本。假設為雙側檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2.結果

2.1 轉染效率檢測 As-miR-222 NC帶有FAM標簽，細胞轉染6h后，熒光顯微鏡下觀看FAM熒光基團如圖所示(圖1)，表明轉染效率較高，可達80%。

圖1 熒光倒置顯微鏡下觀察SACC-LM細胞轉染效率(×100)

2.2 檢測基因轉錄水平 細胞轉染后用qRTPCR檢測miR-222與PUMA的轉錄情況(圖2)。轉染As-miR-222后，實驗組miR-222表達水平明顯下調(P＜0.05)，PUMA轉錄水平顯著增加(P＜0.01)，差異有統計學意義。

圖2 轉染對miR-222和PUMA基因mRNA表達水平的影響

2.3 檢測細胞PUMA蛋白表達水平 Western Blot結果可見，實驗組PUMA蛋白表達顯著增強(圖3)。使用Image J軟件，測量目標蛋白PUMA和內參蛋白GAPDH的灰度值，并計算兩者的比值為(0.496±0.016)、(0.474±0.006)和(0.875±0.058)。轉染后實驗組PUMA蛋白表達顯著增加(P＜0.01)，提示miR-222的沉默可以消除其對PUMA的靶向抑制作用。

圖3 轉染后SACC-LM各組細胞PUMA蛋白的表達情況

2.4 檢測細胞遷移能力 計算每組中細胞遷移的數量(表1)，數據顯示實驗組中通過小室的細胞數量顯著減少(P＜0.01，圖4)，說明抑制miR-222可降低SACC-LM細胞的運動能力。

圖4 轉染后SACC-LM細胞遷移實驗檢測(×100)

表1 各組SACC-LM細胞的遷移數目(×100)

2.5 檢測細胞增殖能力 計算各組的OD450比值，畫圖反映出各個時間點的細胞生長狀況。結果顯示陰性對照組細胞的增殖變化不明顯，而實驗組細胞的增殖則有顯著降低(P＜0.01，圖5)。提示miRNA-222的確能促進高轉移潛能涎腺腺樣囊性癌細胞SACC-LM增殖，通過沉默miRNA-222表達能抑制細胞增殖。

圖5 轉染后SACC-LM細胞的增殖情況

2.6 檢測細胞凋亡情況與周期分布 流式細胞術檢測細胞凋亡，總細胞凋亡率分別為18.59%、19.65%和27.13%，實驗組凋亡率顯著增加(P＜0.01，圖6)。同樣，檢測細胞周期，實驗組G0/G1期的細胞比例顯著增加，而S期和G2/M期則相應減少(P＜0.01，表2)。說明沉默miRNA-222能影響SACC-LM細胞周期分布，并促進其凋亡。3.討論

圖6 轉染后SACC-LM各組細胞凋亡情況

表2 轉染后各組細胞周期分布(x±s，%)

PUMA在細胞的凋亡過程中起重要作用[11，12]。有研究表明，細胞凋亡的行為能防止腫瘤的發生[13]，若PUMA基因突變或缺失，則使凋亡的發生率降低。在惡性腫瘤中，PUMA上游基因p53受損、PUMA啟動子甲基化、Bcl-2蛋白家族抗凋亡蛋白過表達等因素均能導致PUMA等表達降低，抑制PUMA的促凋亡功能[14]?？梢钥闯?，通過過表達腫瘤細胞的PUMA基因，可以增強PUMA介導的細胞凋亡效應，以達到治療腫瘤的目的。

越來越多的miRNAs被研究所證實與腫瘤生長、分化、遷移、侵襲、轉移、凋亡等行為密切相關，是腫瘤治療的潛在靶點[15]。miRNAs在許多腫瘤中表達是異常的[16]，可以看出它在腫瘤的發展中起重要作用。其中，miR-222是常見的促癌miRNAs，在一些腫瘤中高表達，如腦膠質母細胞瘤[17]、甲狀腺乳頭狀癌[18]、前列腺癌[19]等，并與其生長密切相關。Zhang[20]等報道抑制miR-222能上調腦膠質母細胞瘤細胞表達PUMA，并促進細胞凋亡。提示miR-222可以負調節PUMA的表達并影響細胞。miR-222與miR-221是成簇分布的miRNA，二者相鄰并呈前后排列，人miR-221/222核心序列完全同源，有報道PUMA與PTEN是其主要的共同靶基因[21，22]。其中，PTEN能阻斷PI3K/Akt信號通路，抑制腫瘤生長，促進細胞凋亡[23]。Yang等[6]發現miR-221和miR-222同時在口腔鱗癌中高表達，且表達水平與腫瘤生長活性高度相關。同時沉默miR-221/222可使PUMA與PTEN顯著上調[21]。提示以miR-221和miR-222作為聯合靶點的基因治療可能更具優勢，值得進一步的探索。

本實驗通過向高轉移潛能腺樣囊性癌細胞SACC-LM轉入反義鏈，沉默細胞內源性miR-222，進而提高細胞表達PUMA。并進一步通過細胞功能實驗證實，上調SACC-LM細胞的PUMA表達水平，有助于抑制其增殖、遷移的能力，并顯著影響細胞周期，誘導凋亡的發生。綜上所述，本研究通過沉默miR-222上調PUMA表達，揭示出治療轉移性腺樣囊性癌的潛在靶點，并有望為臨床開發抗癌藥物提供參考。