生物樣品汞形態分析方法的研究進展

張文鳳，張冠文，陳云，何嘉耀

（1.中國廣州分析測試中心，廣東省測試分析研究所，廣東廣州510070；2.廣東省疾病預防控制中心國家食品安全風險監測參比實驗室（重金屬），廣東廣州511430）

全球每年通過河流向海洋輸入的汞約有380 t，每年通過地下水輸入到海洋的汞有100 t～800 t，另外，每年約有600 t 的汞由深海熱液噴口產生[1]。馮新斌課題組的研究結果表明，中國地表自然源年均排放約465 t汞[2]。我國是全球汞消費和汞排放大國，人為活動汞排放量達500 t/年～700 t/年[3]。在我國，汞及其化合物的應用主要是催化劑，所占比例達到總用量的70%，其余30%分別應用在以下領域：科學測量儀9%、藥物8%、蒸氣燈5%、電極3%、雷汞2%、淘金3%[1]。

汞具有高致毒性、持久性和長距離遷移性等特征，是一種全世界公認的持久性有毒物質（persistent toxic substance，PTS）。汞是唯一一種能在常溫下呈現液態的重金屬，有7 個穩定同位素，其質量數分別為196、198、199、200、201、202、204，汞的毒性和生物有效性取決于其化學形態。汞及其化合物在環境中普遍存在，各形態的汞之間可以相互轉化，尤其是無機汞可以通過生物甲基化或者光化學反應等過程形成毒性更大的甲基汞，并可通過食物鏈最終在人體內富集，嚴重危害人體健康[4-7]。汞形態分析方法和技術的發展，對相關領域科學研究的發展具有重要的推動作用。由此，總汞及其形態分析的定性和定量分析的巨大市場需求和強烈的人文訴求可見一斑。

前人針對生物樣品汞形態分析的前處理及其分析的方法開展了大量的科學研究工作，過去的幾十年國內外汞的形態分析研究取得了很多突破性的成果。本文從總汞的分析方法、汞形態分析方法及近年來汞形態分析研究方面綜述了生物樣品中汞形態分析方法的研究進展及其新動向。

1 總汞的快速篩查方法

無需前處理的總汞測量方法。試樣無需預處理過程或僅僅經過簡單的預處理（如粉碎或干燥），可直接上機。最具代表性的是美國環保局頒布的方法“Method 7473 （SW-846）：Mercury in Solids and Solutions by Thermal Decomposition，Amalgamation，and Atomic Absorption Spectrophotometry”，中文名為熱分解齊化原子吸收光度法，該方法（以下簡稱EPA 方法7473）可測定固體及液體中的汞含量，原理：試樣經熱解后，汞原子被捕集，隨后經原子吸收光譜檢測。雖然該方法不需要消解過程便可直接測定汞含量、靈敏度高、準確度高、操作簡便，但由于儀器的運行成本高，我國GB 5009.17-2014《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》并未涵蓋該方法[8]。

為了減免試樣的復雜前處理過程，一些可用于化妝品及保健食品中重金屬的快速篩查的“食品藥品安全快速檢測試劑盒（汞快速檢測試紙）”悄然而生，并且在我國已有十多年的歷史。目前常用的汞離子快速檢測有生物酶抑制法、化學顯色法和離子交換法等，可應用于環境水樣、食品、中藥材、紡織等領域的汞含量檢測。這些檢測手段通常用于快速篩查大樣本中的可疑樣本，從而起到排查食品安全事故的作用，但在樣本中目標物含量低時，會出現重現性差、平行性不好等情況。

2 測定總汞的前處理方法

生物樣品（尤其是食品）重金屬的檢測需要低檢出限、高靈敏度的分析方法（檢出限低于1 mg/kg），因此，無法使用X 射線熒光光譜儀這類快速檢測儀器直接進行測定（檢出限通常高于50 mg/kg），此外，汞極易在常溫下揮發，不適合與其它重金屬一起進行酸消解等前處理，常常需要單獨進行預處理。

總汞的前處理方法有濕法酸消解法、微波消解法。GB 5009.17-2014 方法包含了這些前處理方法，包括濕法消解或微波消解、定容、離心等過程，采用冷原子吸收光譜法或原子熒光光譜法進行總汞的測定，由于具有運行成本較低、對技術要求不高等優點，深受基層技術工作者的歡迎。

3 檢測總汞的儀器分析方法

總汞的檢測方法一般包括三大類：光譜法、電化學法和其它方法。據Suvarapu 和Baek 統計，最新的研究報道中大于50%總汞的檢測使用的方法是光譜法，他們將電感耦合等離子體質譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）列入光譜法中，此外還包括冷原子吸收光譜（cold-vapor atomic absorption spectrometry，CV-AAS）、冷原子熒光光譜（cold-vapor atomic fluorescence spectrometry，CV-AFS）以及電感耦合等離子體發射光譜（inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES）等[9-10]。

為了防止汞的記憶效應干擾檢測結果，維持儀器較低的檢出限，經ICP-OES 或ICP-MS 檢測的固體樣品一般需要經過繁瑣的前處理以及稀釋后，才能上機，例如微波輔助消解/萃取和酶水解，而且上機前需要進行靈敏度、精度和重現性等儀器條件的調試[11-17]。CV-AFS 的操作原理：還原劑硼氫化鉀在酸性條件下與樣液反應，樣液中的含汞目標物全部氣化為原子態的汞蒸氣，汞蒸氣被氬氣送入檢測器，汞的絕對含量在特征波長下被測定。

直接測汞儀包括塞曼測汞儀（例如，俄羅斯魯美科思公司生產的塞曼測汞儀RA-915+）、原子吸收直接測汞儀（例如，意大利邁爾斯通公司生產的直接測汞儀DMA-80，美國力可LECO-ALTEC 公司生產的全自動汞含量分析儀AMA 254）、固體同位素質譜儀—多通道接收電感耦合等離子體質譜儀等[18-24]。其中，塞曼測汞儀的原理：基于熱分解混合樣品和塞曼校正技術的原子吸收光譜檢測生成的汞元素總量；原子吸收直接測汞儀的原理：固態或液態的樣品經干燥、程序升溫至特定的溫度，汞蒸汽在氧氣的作用下被金網捕集形成金汞齊，再經高溫加熱同步釋放，在特征波長下檢測總汞的絕對含量。

4 汞形態分析的前處理方法

總汞的分析檢測技術是汞形態分析技術得以發展的基礎，總汞檢測技術日益豐富，促使了基于儀器聯用技術的汞形態分析方法及相關基礎學科的快速發展。

在生物樣品甲基汞的萃取過程中，所使用的試劑有鹽酸（HCl）、濃硝酸（HNO3）、四甲基氫氧化銨（tetramethyl ammonium hydroxide，TMAH）、氫氧化鉀（KOH）、甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）、四乙基硼酸鈉（NaBEt4），萃取后的試樣若過酸或過堿，則需要中和試樣的pH 值后再進行下一個分析步驟；常用的萃取方法有超聲輔助萃取、恒溫振蕩提取和微波輔助萃取，以及不常用的前處理方法，如蒸餾、乙基化、吸附－解吸等。經氣相色譜分析的樣品一般需要進行衍生化處理，常用的衍生化（也稱乙基化）試劑為四乙基硼酸鈉（NaBEt4）。

如上所述，汞形態分析的前處理方法具有多樣化，2013年～2017年研究報道的生物樣品汞形態分析的方法見表1，包括目標物（總汞、無機汞和甲基汞）、生物樣品類別、前處理方法以及儀器分析方法等。

表1 近5年（2013年～2017年）文獻涉及的生物樣品中汞的形態分析方法Table 1 The analytical methodologies of mercury species in biomaterials according to previous studies published in the past five years（2013-2017）

續表1 近5年（2013年～2017年）文獻涉及的生物樣品中汞的形態分析方法Continue table 1 The analytical methodologies of mercury species in biomaterials according to previous studies published in the past five years（2013-2017）

食品中甲基汞的分析檢測按照GB 5009.17-2014方法執行時需要進行一系列的前處理（加酸條件下超聲輔助提取、離心、中和、絡合、定容、過濾），才可上機測試[8]。然而，超聲波輔助萃取法的優缺點：1）萃取效率的穩定性高、儀器運行成本低、人力成本低；2）受超聲波衰減因素的制約，超聲有效作用區域為一環形，如果提取罐的直徑太大，在罐子的周壁就會形成超聲空白區；3）難以保證超聲波器件的安全性，也無法實現超聲罐的密封性；4）前處理時間至少需要半小時。

Teo 等充分肯定了微波輔助萃取法（microwaveassisted extraction，MAE）作為生物樣品（尤其是食品）前處理技術的快速、簡單等優勢所在，同時強調了優化MAE 方法的重要性[46]。微波輔助萃取法作為前處理方法的優勢有：1）在密閉的容器中進行，很好地避免目標物的揮發和溶劑的損失，有效避免前處理過程中的外源污染；2）微波能具有良好的穿透性，可控因素多，節能；3）萃取時間短，一般以秒或分鐘計，省時；4）溶劑的用量少，通常為幾毫升，環保；5）減少稱樣量，當樣品來源稀少時，此優點更為明顯。不可置否，由于無機汞化物和有機汞化物的正辛醇/水分配系數的差別往往較大，因此應用微波法難以實現同步萃取重金屬有機化合物和無機形態的重金屬，部分元素如砷除外[47]。

5 汞形態分析的儀器分析方法及其在基礎研究中的應用

本文以甲基汞的分析方法為例介紹汞形態分析的儀器檢測技術與分析方法。甲基汞的分析包括兩個部分：定性分析（甲基汞形態的甄別）與定量分析（甲基汞含量的測量）。首先，借助液相色譜柱或氣相色譜柱，利用甲基汞和其它含汞化合物在填料上的保留時間不同，使溶液中的甲基汞和其它形態的汞分離，隨后通過催化或熱解等技術使甲基汞轉化為汞蒸氣（汞原子或汞離子），最后根據汞在特征波長253.6 nm 或質量數200.59 下的響應，便可達到定性分析汞的目的。其次，測量汞的含量，在定性的基礎上使用外標法或內標法將試樣中的目標物與標準樣液進行比較分析，從而達到定量分析的目的。目前，最常見的甲基汞的形態分析檢測手段為氣相/液相色譜-冷原子熒光光譜和氣相/液相色譜-電感耦合等離子體質譜等[38-40，43-45]。

原子熒光光譜法經歷了四十多年的發展，取得了令人矚目的成績，但是仍存在重復性和穩定性略差、儀器使用壽命略短等不足。相比之下，有記憶效應但穩定性好的氣相/液相色譜-電感耦合等離子體質譜等技術手段在魚類等復雜生物樣品汞形態分析方面在國際上得到了廣泛的應用和認可。

汞的形態分析是研究汞的毒性、致毒機理、膳食暴露風險等課題的必經之路，離開前者討論后者是不嚴謹甚至不科學的。從這個層面上，可以認為，汞形態分析的儀器檢測技術與分析方法是開展環境化學、地球化學、環境科學、食品安全等基礎學科的相關研究的基礎。

中國科學院地球化學研究所馮新斌課題組及其合作者基于氫氣發生-原子熒光光譜和冷原子熒光光譜等儀器分析方法研究了在汞礦區河流/土壤系統中硒的生物地球化學循環特征及其環境歸趨，在此基礎上對萬山汞礦區域的居民在大米膳食中汞暴露或者硒暴露健康風險進行了評估，并且在對硒的生理學/毒理學意義、汞的毒理學意義以及硒汞相互作用分子機理等進行深入研究的基礎上，提出了健康風險效益值（benefit-risk value，BRV），指出將該指標用于評估大米或魚類膳食中硒汞聯合暴露的健康獲益和風險水平更為科學[48-50]。

此外，基于穩定同位素的汞形態分析方法，是近二十年發展起來的，Yin 等在國內首次建立了基于多接受電感耦合等離子質譜聯用的高精度測定汞同位素組成的方法[21]，這使我國的汞形態分析技術向高精度發展成為了可能。Li 等借助冷蒸氣-多接受電感耦合等離子質譜聯用技術建立了大米樣品甲基汞同位素的分析測試方法[51]。Du 等利用相關試驗數據及同位素的質量分餾和非質量分餾二元混合模型進行計算，發現食用大米甲基汞暴露人群的頭發汞同位素組成與食魚甲基汞暴露人群的差異，證實了頭發汞同位素是示蹤人體汞暴露來源的有力工具[52]。

中國科學院生態環境研究中心江桂斌課題組及其合作者運用多種儀器聯用技術開展了很多汞形態分析與生命科學、食品安全等領域密切相關的前沿研究[53-55]。

李璐借用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜等儀器聯用技術研究了貴州汞礦區的生大米，發現大米中的甲基汞主要以甲基汞半胱氨酸（CH3HgCys）的形式存在，它的形成被認為是甲基汞可以穿越血腦屏障和胎盤屏障的主要原因，然而，甲基汞半胱氨酸（CH3HgCys）經烹飪后，絕大部分降解成其他形式的甲基汞化合物[54]。

孟梅等采用冷原子熒光光譜儀和氣相色譜-原子熒光光譜技術研究軟體動物中總汞和甲基汞的時空變化規律，發現總汞含量隨時間呈現明顯的變化趨勢，隨空間的變化不明顯，螺類中甲基汞比例明顯高于雙殼類[55]。

贠照軍利用二維高效液相色譜技術-電感耦合等離子體質譜聯用技術對正常人體血漿蛋白中汞的形態及含量進行在線監測，發現了在血漿中存在汞結合蛋白，經高效液相色譜-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質譜鑒定該蛋白為人血清白蛋白，經等溫滴定量熱法等方法進行表征，發現Hg2+主要結合在為人血清白蛋白的蛋白Cys34 殘基上[53]。

6 結論與展望

綜上所述，汞的形態分析研究取得了一系列重要進展。從目標物的角度看，目標物從單一的總汞總量分析向不同形態化合物（如甲基汞、無機汞）分析轉變，從化合物分析（如氯化甲基汞，CH3HgCl）向指定質量數的化合物（如201 標記的氯化甲基汞，CH3201HgCl）分析演變。從分析儀器的角度看，基于光譜學、質譜學的汞分析儀器趨于多樣化，如CV-AAS、CV-AFS、ICPMS，以及基于這些檢測手段的汞形態分析儀器聯用技術層出不窮，如色譜－光譜聯用技術，其中色譜模塊包括液相色譜、氣相色譜、毛細管電泳色譜等。

筆者推測提高實驗室方法中汞形態分析前處理方法的時效性、靈敏度和準確度，降低儀器的檢出限等將成為日后的研究方向，今后還可在以下幾個方面進行重點研究：1）檢測方法快速運行，提高時效性；2）聯用儀器小型化設計，增加儀器和方法的可移動性；3）便攜式儀器，增強適用性；4）多種已有儀器重組形成新儀器，衍生出新的儀器聯用技術。由于快速檢測能滿足廣大市場的需求，多功能檢測試紙和多通道檢測儀也將是日后的研究重點；而隨著儀器技術的發展，需要也將越來越大，汞形態分析的檢測方法和技術將會帶來巨大的經濟和社會效益。