油茶葉多酚的提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化性的研究

藍(lán)梧濤，吳雪輝，2，章 文，王澤富，江盛宇

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642； 2.廣東省油茶工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

多酚是苯環(huán)上具有多元酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物總稱，廣泛分布于植物中的各個(gè)部分，具有較強(qiáng)的清除自由基、抗腫瘤、抗炎抗癌、降血脂的作用，在食品、藥品、營(yíng)養(yǎng)保健、日用化工等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。據(jù)報(bào)道[3-4]，被作為廢棄物丟棄的植物葉片中含有較高含量的多酚，若能合理開發(fā)，必然具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

油茶籽油含有多種活性成分，具有較高的保健價(jià)值及藥用功效，長(zhǎng)期食用有益于人體健康[5-7]。近些年，油茶的種植面積逐年增加，為促進(jìn)油茶的生長(zhǎng)發(fā)育及提高油茶果產(chǎn)量，每年需要對(duì)油茶樹進(jìn)行修枝整形，在此過程中會(huì)產(chǎn)生大量的油茶葉，而大部分油茶葉利用度較低[8-11]。

研究表明，油茶葉富含多酚、黃酮、多糖、三萜皂苷、甾體等物質(zhì)，其提取液具有降血糖、抗凝血、抗血栓形成等功效，若能有效利用其中的活性成分，可以提高油茶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12-13]。目前與油茶葉活性成分相關(guān)的研究主要集中在黃酮[14-15]，針對(duì)多酚的研究相對(duì)較少。為了進(jìn)一步研究油茶葉多酚的功效，本文以油茶葉為原料，研究油茶葉中多酚的提取工藝，并對(duì)油茶葉多酚與VC進(jìn)行體外抗氧化活性的分析，以充分利用油茶葉資源，變廢為寶，推動(dòng)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油茶葉，采摘于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城寧西教學(xué)科研基地。

無(wú)水乙醇、無(wú)水碳酸鈉、福林酚、過硫酸鉀、濃鹽酸、Tris、鄰苯三酚、抗壞血酸：分析純；沒食子酸、DPPH、ABTS標(biāo)準(zhǔn)品。

BSA223S型分析天平，UV-5200紫外可見分光光度計(jì)，JB-3型恒溫磁力攪拌器，WRH-100TB1型閉環(huán)除濕熱泵干燥機(jī)，BJ-150型多功能粉碎機(jī)，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

新鮮、無(wú)病蟲害的油茶葉采用熱泵于60℃條件下干燥至恒重，粉碎，收集40～60目的粉末，備用。

1.2.2 油茶葉多酚的提取

稱取適量油茶葉粉末，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在適宜的溫度下進(jìn)行攪拌提取一段時(shí)間，抽濾收集提取液，定容至50 mL，測(cè)定多酚含量，并按下式計(jì)算多酚提取量。

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的提取液中多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為油茶葉質(zhì)量,g。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定

多酚含量按照GB/T 8313—2008的步驟，采用福林酚比色法進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.2.4 體外抗氧化活性測(cè)定

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Design-Expert 8.0.6、Origin 9.0、Matlab R2016b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響

稱取1.000 g油茶葉粉末5份，分別加入體積分?jǐn)?shù)20%、30%、40%、50%、60%的乙醇溶液40 mL，在50℃的條件下攪拌提取15 min，抽濾收集提取液定容至50 mL，測(cè)定吸光值并計(jì)算多酚的提取量。結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚提取量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～50%范圍內(nèi)，多酚提取量較高，這是由于多酚屬于弱極性物質(zhì)，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶液體系的極性降低，使得提取量增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過50%時(shí)，多酚提取量開始下降，可能是由于溶液體系的極性與油茶葉多酚極性之間的差異增大，導(dǎo)致提取量降低。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響

以40%的乙醇溶液為提取溶劑，提取時(shí)間分別為5、15、25、35、45 min，其余條件同2.1.1進(jìn)行提取。結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚提取量逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到35 min時(shí)，多酚提取量最大，為56.71 mg/g，此后，延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取量反而有所下降。根據(jù)菲克定理，在一定范圍內(nèi)，油茶葉顆粒內(nèi)部與溶劑中的多酚濃度差較大，提取時(shí)間與多酚提取量呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，顆粒內(nèi)外濃度差逐漸趨于平衡，提取量不再增大，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取量下降可能是由于多酚暴露在空氣中，發(fā)生部分氧化。

2.1.3 提取溫度對(duì)多酚提取量的影響

分別設(shè)定提取溫度為30、40、50、60、70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，其余條件同2.1.1進(jìn)行提取。結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)多酚提取量的影響

由圖3可知，多酚提取量隨著提取溫度的升高先增加后降低。這是由于適當(dāng)?shù)厣咛崛囟龋肿舆\(yùn)動(dòng)速率加快，有利于油茶葉多酚的溶出。當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時(shí)，多酚提取量最高，為59.91 mg/g。

2.1.4 料液比對(duì)多酚提取量的影響

以40%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，其余條件同2.1.1進(jìn)行提取。結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對(duì)多酚提取量的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，多酚提取量迅速增大，這是由于增大溶劑用量，有利于多酚物質(zhì)由顆粒內(nèi)部向溶劑擴(kuò)散。當(dāng)料液比為1∶60時(shí)，多酚提取量達(dá)到57.27 mg/g，此后再增大料液比，多酚提取量基本不變。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)、料液比(X4)作為自變量，油茶葉多酚提取量(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)方案。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1，響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表2 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design-Expert軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到多酚提取量(Y)的二元多項(xiàng)回歸方程：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析

注：* *差異極顯著(P<0.01),*差異顯著(P<0.05)。

通過對(duì)模型的擬合分析，預(yù)測(cè)出最佳的提取條件為：提取時(shí)間35 min，提取溫度68.84℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)31.63%，料液比1∶68.41，預(yù)測(cè)的油茶葉多酚提取量為68.18 mg/g。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，考慮到實(shí)際操作，將各因素調(diào)整為提取時(shí)間35 min、提取溫度69℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)32%、料液比1∶69，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到油茶葉多酚提取量為67.31 mg/g,預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.29%。說明模型能較好地預(yù)測(cè)油茶葉多酚提取量。

2.4 油茶葉多酚對(duì)DPPH·的清除能力

圖5為不同質(zhì)量濃度的油茶葉多酚和VC對(duì)DPPH·的清除效果。

圖5 油茶葉多酚和VC清除DPPH·的比較

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，油茶葉多酚和VC對(duì)DPPH·的清除率均逐漸增大，表現(xiàn)出較好的抗氧化效果。在質(zhì)量濃度為3.9～11.36 μg/mL范圍內(nèi)，油茶葉多酚對(duì)DPPH·的清除率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的線性相關(guān)性，回歸方程為Y=0.055 8X+0.272 5(R2=0.973 9)，IC50值為4.22 μg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度超過11.36 μg/mL，清除率緩慢升高，最大清除率為90.2%；對(duì)于VC，在質(zhì)量濃度為3.82～15.26 μg/mL范圍內(nèi)，線性回歸方程為Y=0.054 5X+0.022 6(R2=0.984 6)，IC50值為8.073 μg/mL，最大清除率略低于油茶葉多酚，為81.86%。綜上所述，油茶葉多酚較VC對(duì)DPPH·清除能力更強(qiáng)。

2.5 油茶葉多酚對(duì)ABTS+·的清除能力

圖6為不同質(zhì)量濃度的油茶葉多酚與VC清除ABTS+·的能力。

由圖6可知，油茶葉多酚對(duì)ABTS+·的清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)的關(guān)系，質(zhì)量濃度越大，清除能力越好，IC50值為5.22 μg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度為19.17 μg/mL時(shí)，ABTS+·清除率達(dá)到100%。而VC的IC50值為8.69 μg/mL，在19.17 μg/mL時(shí)，ABTS+·清除率達(dá)到99.65%。由此可知，與清除DPPH·的結(jié)果類似，油茶葉多酚清除ABTS+·的活性同樣優(yōu)于VC，并且當(dāng)油茶葉多酚達(dá)到一定的質(zhì)量濃度時(shí)，能完全清除ABTS+·。

圖6 油茶葉多酚和VC清除ABTS+·的比較

2.6 油茶葉多酚對(duì)的清除能力

圖7 油茶葉多酚和VC清除的比較

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到油茶葉多酚的最佳提取條件為提取時(shí)間35 min、提取溫度69℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)32%、料液比1∶69，在此條件下，油茶葉多酚的提取量為67.31 mg/g。