黃體酮對(duì)成年斑馬魚(yú)下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的干擾效應(yīng)

梁燕秋, 董忠典, 黃國(guó)勇, 田斐, 李進(jìn), 應(yīng)光國(guó),*

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黃體酮對(duì)成年斑馬魚(yú)下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的干擾效應(yīng)

梁燕秋1,2, 董忠典1,*, 黃國(guó)勇2,3, 田斐4, 李進(jìn)1, 應(yīng)光國(guó)2,3,*

1. 廣東海洋大學(xué), 湛江 524088 2. 中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所, 廣州 510640 3. 華南師范大學(xué), 廣州 510631 4. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣州 510300

黃體酮(P4)是一種類(lèi)固醇激素。為了探究P4的內(nèi)分泌干擾效應(yīng), 選擇成年斑馬魚(yú)()作為受試生物, 研究了P4對(duì)斑馬魚(yú)下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響。成年斑馬魚(yú)在不同濃度P4(2、11和16 ng·L–1)下處理21 d。結(jié)果顯示: 暴露于高濃度組的P4能夠抑制雌魚(yú)大腦中促性腺激素釋放激素2()、促性腺激素釋放激素3(), 卵泡刺激素()、雌激素受體1()基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá); 然而誘導(dǎo)了雄魚(yú)大腦中、黃體生成素()、雄激素受體()基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 這些轉(zhuǎn)錄變化暗示了P4對(duì)成年斑馬魚(yú)有潛在的弱雄激素效應(yīng)。此外, P4暴露對(duì)雌魚(yú)卵巢和雄魚(yú)精巢類(lèi)固醇合成途徑中固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白()、細(xì)胞色素p450介導(dǎo)側(cè)鏈裂解酶()、17α羥化酶()、卵巢細(xì)胞色素P450芳香化酶()、11β羥化酶()、羥基類(lèi)固醇3β脫氫酶()、羥基類(lèi)固醇20β脫氫酶()、羥基類(lèi)固醇17β脫氫酶3()、羥基類(lèi)固醇11β脫氫酶2()以及受體信號(hào)途徑中孕激素受體()、、基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒(méi)有顯著影響。可見(jiàn), 在P4暴露下, 斑馬魚(yú)大腦比性腺更加敏感?？偠灾? P4能夠改變斑馬魚(yú)大腦中HPG軸相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平, 進(jìn)而對(duì)斑馬魚(yú)的內(nèi)分泌系統(tǒng)具有潛在的危險(xiǎn)。

孕激素; 黃體酮; 內(nèi)分泌干擾; 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)

0 前言

近年來(lái), 水環(huán)境中類(lèi)固醇激素因其高的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)而得到了人們的廣泛關(guān)注。類(lèi)固醇激素主要包括雌激素、雄激素、孕激素、鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素。過(guò)去, 人們主要關(guān)注了雌激素和雄激素的內(nèi)分泌干擾效應(yīng), 而對(duì)孕激素的的研究則很少。孕激素主要應(yīng)用于人類(lèi)口服避孕藥和激素替代療法中, 用于避孕和治療各種內(nèi)分泌疾病[1]。此外, 畜牧養(yǎng)殖業(yè)中也使用孕激素來(lái)提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度以及控制母畜同期排卵和預(yù)防母畜流產(chǎn), 從而提高產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益[2-4]。由于污水處理廠去除不徹底、動(dòng)物的直接排泄和污水的直接排放, 導(dǎo)致了孕激素在污水處理廠出水、養(yǎng)殖場(chǎng)廢水和地表水等水環(huán)境介質(zhì)中都能檢出, 其濃度在幾個(gè)ng·L-1到幾萬(wàn)ng·L-1不等[5-18]。其中, 黃體酮(P4)在地表水和城市污水處理廠出水中檢出濃度分別為199 ng·L-1和1 ng·L-1[11, 19]。此外, 在養(yǎng)豬場(chǎng)和奶牛場(chǎng)沖刷水中還檢出相當(dāng)高濃度的P4, 濃度分別3470·ng·L-1和11900·ng·L-1[10, 12]。令人驚訝的是, P4在養(yǎng)豬場(chǎng)廢水排放河流中也能檢出, 濃度為30.5 ng·L-1[12]。環(huán)境中殘留的孕激素物質(zhì)(包括P4)將會(huì)對(duì)受納水體中的水生生物有潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

目前已經(jīng)報(bào)道了許多孕激素物質(zhì)(如左炔諾孕酮、孕二烯酮、屈螺酮、去氧孕烯、炔諾酮、醋酸甲地孕酮和去氫孕酮)在非常低濃度時(shí)就會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng), 抑制魚(yú)的生殖能力[20-24]。至于P4, 它的生殖毒性也有所研究[25-26], 然而關(guān)于其作用機(jī)制到目前為止還不清楚。

本研究選取斑馬魚(yú)作為受試生物, 從分子水平研究孕激素物質(zhì)P4低濃度暴露對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響, 探討P4對(duì)斑馬魚(yú)的分子作用機(jī)制, 以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)P4對(duì)斑馬魚(yú)的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 化合物

P4(CAS 57-83-0)購(gòu)買(mǎi)于Tokyo Chemical Industry公司(上海, 中國(guó)), P4溶于無(wú)水乙醇并配成濃度為1 mg·mL-1的母液, 置于–20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)魚(yú)類(lèi)

健康3月齡成年斑馬魚(yú)()購(gòu)買(mǎi)于廣州市花地灣花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng), 然后轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室水族箱(45 L)馴養(yǎng)兩個(gè)月。飼養(yǎng)斑馬魚(yú)的水為曝氣2 d以上的自來(lái)水, 水的氧飽和度>80%, 水溫為26±1℃, 光暗周期比為14 h: 10 h, pH控制在7—8范圍內(nèi)。每天早上和下午分別投喂冰凍紅蟲(chóng)(larvae)和豐年蝦()。馴養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取10 L的玻璃缸作為暴露容器, 暴露溶液的體積為5 L。每缸放入健康的雌魚(yú)和雄魚(yú)各4條。斑馬魚(yú)成魚(yú)暴露于三個(gè)濃度梯度的P4(5 ng·L-1、50 ng·L-1和100 ng·L-1), 同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組(含0.001%的乙醇)。所有P4暴露組均含有0.001%(v/v)乙醇助溶劑。每個(gè)處理組設(shè)置4個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)暴露周期為21 d, 暴露用水每天更新。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水溫保持在(26±1)℃, 光暗周期為14 h:10 h。每天早上和下午分別投喂冰凍紅蟲(chóng)和豐年蝦。在暴露期間, 每天記錄魚(yú)的死亡率、不正常的行為表現(xiàn)等。在暴露21 d后, 將所有魚(yú)置于冰上麻醉后馬上測(cè)量魚(yú)的全長(zhǎng)(cm)和濕重(g), 以便計(jì)算生長(zhǎng)狀況因子(condition factor,)。生長(zhǎng)狀況因子計(jì)算公式為=(濕重/全長(zhǎng)3)×100。測(cè)量結(jié)束后, 將魚(yú)解剖, 取出大腦和性腺組織(卵巢和精巢), 保存于RNAlater中, 用于分析HPG軸相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 基因轉(zhuǎn)錄水平分析

根據(jù)我們之前的研究方法[27], 利用Invitrogen公司的TRIzol試劑從斑馬魚(yú)大腦和性腺組織中提取總RNA, 然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)總RNA質(zhì)量, 使用美國(guó)Bio-Rad公司的SmartSpecTMPlus Spectrophotometer儀器測(cè)定RNA樣品在260 nm波長(zhǎng)下的吸光值, 進(jìn)而確定總RNA的濃度, 并根據(jù)A260/A280的比值來(lái)分析總RNA的純度。所有RNA樣品A260/A280的比值在1.8—2.0之間, 符合接下來(lái)實(shí)驗(yàn)要求。根據(jù)Toyobo公司ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒的指導(dǎo)方法, 將大約2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成總體積為50 μL的cDNA。反應(yīng)結(jié)束后, 加入150 μL的DEPC(焦碳酸二乙酯)水將合成cDNA稀釋到最終體積為200 μL, 并于-20℃下保存。

在ABI公司Applied Biosystems ViiATM7 Dx儀器上進(jìn)行所有實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)。每個(gè)qRT-PCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL, 包括0.4 μL的上游引物(10 μM)、0.4 μL的下游引物(10 μM)、10 μL THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix試劑(Toyobo)、2.5 μL的cDNA樣品和6.7 μL的DEPC水。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增按以下程序進(jìn)行: 95 ℃× 1 min預(yù)變性后, 在95 ℃× 15 s, 60 ℃× 60 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

我們之前的研究已經(jīng)報(bào)道了目標(biāo)基因和內(nèi)參基因引物序列的詳細(xì)信息, 包括基因名稱(chēng)、基因登錄號(hào)、核酸序列、擴(kuò)增子大小等[28], 所有引物的擴(kuò)增效率在96%—107%之間。選取了15個(gè)與HPG軸相關(guān)的基因, 檢測(cè)了雌魚(yú)和雄魚(yú)大腦中促性腺激素釋放激素2()、促性腺激素釋放激素3()、卵泡刺激素()黃體生成素()、孕激素受體()、雌激素受體1()和雄激素受體()基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平以及卵巢和精巢中固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白()、細(xì)胞色素p450介導(dǎo)側(cè)鏈裂解酶()、卵巢細(xì)胞色素P450芳香化酶()、11β羥化酶()、羥基類(lèi)固醇3β脫氫酶()、羥基類(lèi)固醇20β脫氫酶()、羥基類(lèi)固醇17β脫氫酶3()、羥基類(lèi)固醇11β脫氫酶2()、、和基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。選取、和作為內(nèi)參基因是因?yàn)樗麄冊(cè)谌軇?duì)照組和處理組之間的穩(wěn)定表達(dá)。而且, 已經(jīng)報(bào)道使用多個(gè)內(nèi)參基因能夠更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平[29]。所以, 本研究中采用、和這三個(gè)內(nèi)參基因的平均值對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理。按照Livak and Schmittgen[30]的2?ΔΔCt方法評(píng)估目標(biāo)基因相對(duì)于參照因子(溶劑對(duì)照組的樣品)的相對(duì)表達(dá)量, 結(jié)果以log2的形式表示。

1.5 暴露水溶液中P4的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)每天更新暴露水體以保持各暴露組P4的濃度穩(wěn)定。所有處理組的水樣只在暴露第14 d開(kāi)始暴露時(shí)(0 h)和換水前(24 h)這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集。每個(gè)平行收集500 mL的水樣, 每個(gè)處理組有4個(gè)平行。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的第一個(gè)平行和第二個(gè)平行的水樣混合在一起作為第一個(gè)混合水樣品; 第三個(gè)平行和第四個(gè)平行的水樣混合在一起作為第二個(gè)混合水樣品。利用固相萃取柱(Oasis HLB, 6 mL, 500 mg)從水樣中提取目標(biāo)化合物P4, 然后抽干固相萃取柱, 接著用10 mL的色譜純的乙酸乙酯洗脫固相萃取柱子。將洗脫液置于緩慢氣流氮?dú)庵? 吹掉乙酸乙酯。用1 mL色譜純的甲醇重新溶解氮吹后玻璃管中的殘留物, 并上機(jī)檢測(cè)。目標(biāo)化合物P4采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-MS/MS)(Agilent 1200 LC-Agilent 6460 QQQ, USA)進(jìn)行分析測(cè)定[9]。P4在水樣中的檢出限和回收率分別為0.05 ng·L-1和92.4%—102%[9]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示, 采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, 并用Origin 8.0進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)分別通過(guò)Kolmogorov-Simirnov和Levene’s tests進(jìn)行驗(yàn)證。采用單因素方差分析方法中的Tukey多重比較法對(duì)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。當(dāng)≤ 0.05(*),≤ 0.01(**)和≤ 0.001(***)時(shí), 表示暴露組與溶劑對(duì)照組有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 暴露水體中P4的濃度

如圖表1所示, P4在T時(shí)刻的實(shí)測(cè)濃度比名義濃度低, 且在24 h后進(jìn)一步降低了, 甚至在低濃度和中濃度暴露組中沒(méi)有檢測(cè)到。P4在三個(gè)暴露溶液的平均濃度分別為2 ng·L–1、11 ng·L–1和16 ng·L–1。另外, P4在溶劑對(duì)照組中沒(méi)有檢測(cè)到。所有暴露濃度數(shù)據(jù)都以它的實(shí)測(cè)濃度表示。

2.2 P4對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)的存活和生長(zhǎng)情況的影響

在暴露期間, 所有處理組都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)死魚(yú)情況。P4沒(méi)有對(duì)斑馬魚(yú)的全長(zhǎng)(total body length)、濕重(wet weight)和生長(zhǎng)狀況因子(condition factor,)等產(chǎn)生顯著的影響(見(jiàn)表2)。

2.3 P4對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)HPG軸相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.3.1 P4對(duì)雌魚(yú)大腦中促性腺激素釋放激素基因和促性腺激素基因以及相關(guān)激素受體基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響

由圖1可知, 與溶劑對(duì)照組相比, 16 ng·L-1的P4可以使雌性斑馬魚(yú)大腦中和基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著降低, 但在低濃度和中濃度P4處理下沒(méi)有出現(xiàn)顯著性變化。相類(lèi)似地, 11和16 ng·L-1的P4也顯著抑制了雌性斑馬魚(yú)大腦中和基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。所有處理濃度的P4對(duì)雌性斑馬魚(yú)大腦中、和基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒(méi)有顯著影響。

表1 P4在暴露溶液中的名義濃度和實(shí)測(cè)濃度

注:a暴露時(shí)間 (0 h和24 h);b測(cè)定濃度為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3.2 P4對(duì)雌魚(yú)卵巢中類(lèi)固醇合成途徑相關(guān)基因以及相關(guān)激素受體基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響

由圖2可知, 所有濃度處理組的P4對(duì)雌性斑馬魚(yú)卵巢中類(lèi)固醇合成途徑(、、、、、、、和)和相關(guān)激素受體基因(、和)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒(méi)有顯著影響。

2.3.3 P4對(duì)雄魚(yú)大腦中促性腺激素釋放激素基因和促性腺激素基因以及相關(guān)激素受體基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響

由圖3可知, 與溶劑對(duì)照組相比, 16 ng·L-1的P4顯著誘導(dǎo)了雄魚(yú)大腦中、和基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平, 而在2和11 ng·L-1的P4處理下則沒(méi)有出現(xiàn)顯著性的變化。然而, 所有濃度組的P4沒(méi)有顯著改變雄魚(yú)大腦中、、、和基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.3.4 P4對(duì)雄魚(yú)精巢中類(lèi)固醇合成途徑相關(guān)基因以及相關(guān)受體基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響

由圖4可知, 所有濃度處理組的P4對(duì)雄性斑馬魚(yú)精巢中類(lèi)固醇合成途徑(、、、、、、、和)和相關(guān)激素受體基因(、和)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒(méi)有顯著影響。

表2 在不同濃度P4處理下21天后的斑馬魚(yú)成魚(yú)全長(zhǎng)、濕重和生長(zhǎng)狀況因子(K)的變化情況

注: 結(jié)果表現(xiàn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差; n為4個(gè)平行樣品, 每個(gè)平行樣品中雌雄魚(yú)各4條。

注: 與溶劑對(duì)照組相比, 具有顯著性差異的組別用星號(hào)表示(*P≤ 0.05, ** P≤ 0.01, *** P≤ 0.001)。

Figure 1 Expression of,,,,,andmRNA in the brain of females in zebrafish after exposure to P4

圖2 P4對(duì)斑馬魚(yú)雌魚(yú)卵巢中star、cyp11a1、cyp17、cyp19a1a、cyp11b、hsd3b、hsd20b、hsd17b3、hsd11b2、pgr、esr1和ar基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響

Figure 2 Expression of,,,,,,,,,,andmRNA in the ovary of females in zebrafish after exposure to P4

3 討論

在斑馬魚(yú)成魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)中, P4的實(shí)測(cè)濃度在開(kāi)始暴露時(shí)(T)就出現(xiàn)了明顯的降低, 尤其是在高濃度暴露組降低了70%。由于T時(shí)刻的水樣是換完水后直接從魚(yú)缸中收集的, 所以P4的損失有可能是被斑馬魚(yú)個(gè)體消耗了, 或是被糞便中的微生物降解了, 進(jìn)而說(shuō)明了P4是比較不穩(wěn)定的。在24小時(shí)的暴露后, P4在低濃度和中濃度暴露組完全沒(méi)有檢出, 而在高濃度暴露組降低了90%。Blüthgen et al.[31]的研究也顯示了P4在斑馬魚(yú)成魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)降低了90%。此外, 我們之前的研究報(bào)道了P4在斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)中降低了50%[32], 而在斑馬魚(yú)早期胚胎暴露實(shí)驗(yàn)中基本與名義濃度保持一致[33]。這些研究結(jié)果總體上說(shuō)明了P4在成魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)中要比胚胎和幼魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)中很容易被水中微生物降解。Liu et al.[34]通過(guò)活性污泥中耗養(yǎng)生物降解菌實(shí)驗(yàn)顯示P4的半衰期為4.3小時(shí), 這進(jìn)一步說(shuō)明了P4很容易被微生物去除。

注: 與溶劑對(duì)照組相比, 具有顯著性差異的組別用星號(hào)表示(*P≤ 0.05, ** P≤ 0.01, *** P≤ 0.001)。

Figure 3 Expression of,,,,,andmRNA in the brain of males in zebrafish after exposure to P4

圖4 P4對(duì)斑馬魚(yú)雄魚(yú)精巢中star、cyp11a1、cyp17、cyp19a1a、cyp11b、hsd3b、hsd20b、hsd17b3、hsd11b2、pgr、esr1和ar基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響

Figure 4 Expression of,,,,,,,,,,andmRNA in the testis of males in zebrafish after exposure to P4

本文研究發(fā)現(xiàn)了P4能夠調(diào)節(jié)與HPG軸相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。P4沒(méi)有顯著改變斑馬魚(yú)卵巢和精巢中的類(lèi)固醇基因(、、、、、、、和)和受體基因(、和)的轉(zhuǎn)錄水平, 這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的成魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相一致的[35]。然而, 在我們之前的胚胎和幼魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)中, P4能夠調(diào)節(jié)類(lèi)固醇基因和受體基因的轉(zhuǎn)錄水平[33, 36]。這些基因在胚胎、幼魚(yú)和成魚(yú)階段的不同轉(zhuǎn)錄水平說(shuō)明了它們是與時(shí)間相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式, 也是發(fā)育階段相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式, 這和之前文獻(xiàn)報(bào)道的另一種化合物是相一致的[37]。在雌魚(yú)大腦中, P4暴露降低了、、和基因的轉(zhuǎn)錄水平; 然而, 在雄魚(yú)大腦中, P4暴露提高了、和基因轉(zhuǎn)錄水平。這說(shuō)明了P4對(duì)雌雄魚(yú)大腦基因的調(diào)節(jié)模式是相反的。P4主要是通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式來(lái)抑制、和基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 進(jìn)而導(dǎo)致促性腺激素釋放激素(GNRH2和GNRH3)和促性腺激素(FSH)的合成和分泌, 最終抑制了雌魚(yú)大腦雌激素受體基因()的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平, 說(shuō)明了P4有潛在的抗雌激素效應(yīng)。然而, P4則是通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)的方式來(lái)誘導(dǎo)和基因的轉(zhuǎn)錄水平, 進(jìn)而促進(jìn)了促性腺激素(FSH和LH)的合成和分泌, 最終提高了雄魚(yú)大腦雄激素受體基因()的轉(zhuǎn)錄水平, 說(shuō)明了P4有潛在的雄激素效應(yīng)。Hou et al.[38]顯示P4降低了食蚊魚(yú)肝臟中雌激素受體基因的轉(zhuǎn)錄水平, 而提高了雄激素受體的轉(zhuǎn)錄水平, 與本文的研究結(jié)果一致。此外, Hou et al.[38]還顯示了P4能夠引起雌性食蚊魚(yú)發(fā)生了輕微的雄性化效應(yīng), 進(jìn)一步說(shuō)明了P4具有弱雄激素效應(yīng)。然而, 我們之前的研究報(bào)道了P4能誘導(dǎo)斑馬魚(yú)產(chǎn)生更多的雌魚(yú), 但沒(méi)有改變和基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[32], 與本文中P4的弱雄激素效應(yīng)不一致。這說(shuō)明了P4對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的性別分化影響并不是通過(guò)激素受體來(lái)調(diào)節(jié), 具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待以后的進(jìn)一步研究。本研究中P4并沒(méi)有改變斑馬魚(yú)大腦和性腺中基因的轉(zhuǎn)錄水平, 與Zucchi et al.[35]的研究結(jié)果是一樣的。這可能是由于P4的活性要比魚(yú)體內(nèi)特有的孕激素(17α,20β-DHP)活性低造成的[39-40]?？偠灾? 對(duì)于P4暴露來(lái)說(shuō), 大腦比性腺更加敏感。

圖5總結(jié)了P4對(duì)斑馬魚(yú)全生命周期各個(gè)發(fā)育階段(胚胎、幼魚(yú)和成魚(yú))的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。P4對(duì)胚胎階段HPG軸相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響, 有可能影響幼魚(yú)性別分化以及干擾成魚(yú)的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng); 同樣地, P4對(duì)幼魚(yú)性別分化的影響, 也有可能干擾成魚(yú)的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)。這些潛在的影響需要進(jìn)一步的全生命周期暴露實(shí)驗(yàn)(從胚胎開(kāi)始暴露直到成年)來(lái)驗(yàn)證。

圖5 P4對(duì)斑馬魚(yú)不同發(fā)育階段的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。實(shí)線是P4暴露的3個(gè)實(shí)驗(yàn), 虛線是指3個(gè)實(shí)驗(yàn)之間存在的潛在關(guān)系

Figure 5 Endocrine disrupting effects of P4 on the different stages of zebrafish. The solid lines designate P4 exposure each of the three studies depicted. The dashed lines represent possible linkages among the three studies

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The effects of progesterone on the mRNA expression of genes involved in hypothalamic-pituitary-gonadal axis in adult zebrafish

LIANG Yanqiu1, 2, DONG Zhongdian1*, HUANG Guoyong2, 3, TIAN Fei4, LI Jin1, YING Guangguo2, 3*

1. Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 2. Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China 3. South China Normal University, Guangzhou 510631, China 4.South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China

Progesterone (P4) is a steroid hormone. In order to reveal the endocrine disrupting effects of P4, the adult zebrafish () was exposed to 2, 11 and 16 ng·L-1P4 for 21 days, and the transcriptional expression profiles along the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis were determined. The results showed that the highest P4 exposure led to a significant down-regulation ofgonadotropin-releasing hormone 2 (), gonadotropin-releasing hormone 3 (), follicle stimulating hormone beta polypeptide () and estrogen receptor 1 () genes in the brains of females, and up-regulation of, luteinizing hormone beta polypeptide () and androgen receptor () genes in the brains of males. These transcriptional alterations implied that P4 could exhibit the potent weak androgenic activities in adult zebrafish. In addition, P4 exposure had no significant effects on the transcriptional profiles of target genes related to the steroidogenic pathways [steroidogenic acute regulatory protein (), cytochrome P450-mediated side-chain cleavage enzyme (), 17-alpha-hydroxylase (), ovarian cytochrome P450 aromatase (), 1-beta-hydroxylase (), hydroxysteroid 3-beta dehydrogenase (), hydroxysteroid 20-beta dehydrogenase (), hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase type 3 () and hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2 ()] and hormone receptor genes [progesterone receptor (),and] in the ovaries of females and testes of males. Therefore, the brain was more sensitive to P4 exposure than the gonad in zebrafish. Taken together, the overall results demonstrated that P4 could significantly affect transcriptional expression levels of genes related to HPG axis in the brains, which may pose potential adverse effects to the endocrine system of zebrafish.

progestin; progesterone; endocrine disruption; gene transcription

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.02.001

X174

A

1008-8873(2019)02-001-08

2019-01-03;

2019-03-06

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017A030310662, 2017A030313220, 2018A030307020); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(4180060608); 廣東海洋大學(xué)科研啟動(dòng)費(fèi)資助項(xiàng)目(R17075)

梁燕秋(1989—), 女, 廣東茂名人, 博士, 講師, 主要從事環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué), E-mail: liangyanqiu11@163.com

董忠典, 男, 博士, 講師, 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖及分子生物學(xué)研究, E-mail: dzhd888@163.com

應(yīng)光國(guó), 男, 博士, 教授, 主要從事環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)研究, E-mail: guangguo.ying@gmail.com

梁燕秋, 董忠典, 黃國(guó)勇, 等. 黃體酮對(duì)成年斑馬魚(yú)下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的干擾效應(yīng)[J]. 生態(tài)科學(xué), 2019, 38(2): 1-8.

LIANG Yanqiu, DONG Zhongdian, HUANG Guoyong, et al. The effects of progesterone on the mRNA expression of genes involved in hypothalamic-pituitary-gonadal axis in adult zebrafish[J]. Ecological Science, 2019, 38(2): 1-8.