外源氮肥和腐熟劑對小麥秸稈腐解的影響

朱遠芃，金夢燦，馬超，廣敏，高敏，郜紅建

農田生態保育與污染防控安徽省重點實驗室/安徽農業大學資源與環境學院，安徽 合肥 230036

中國秸稈資源可收集量約9.0億噸，所含的氮（N）、磷（P2O5）、鉀（K2O）養分總量分別達到 625.6、197.9、1159.5萬噸（宋大利等，2018）。秸稈還田作為培肥土壤的有效方式，可改善土壤物理結構、增加養分儲量，提高土壤有機質含量和土壤微生物活性。由于還田秸稈腐解速率低、腐解微生物與作物爭氮以及作物病蟲害加重等負面效應而引起廣泛關注（馬驍軒等，2016；丁雪麗等，2008；王愛玲等，2003）。

秸稈腐解過程是影響養分循環和作物利用的主要因素，其腐解速率受秸稈本身的化學組成、溫度、通氣和水分等外界環境的制約。不同種類的植物秸稈、同種植物不同組織器官或不同株齡，其化學組成存在顯著差異，降解速率也不同（Kabuyah et al.，2012）。秸稈腐解過程受秸稈含氮量、C/N和木質素含量等因素的影響（Jing et al.，2016；Li et al.，2017）。秸稈含氮量越高，木質素含量越低，或者C/N和木質素/N越低，越有利于秸稈腐解（Dannehl et al.，2017）。添加適量的無機氮素有利于秸稈腐解（Shahzad et al.，2015），但高濃度的無機氮素會抑制微生物活性，進而影響秸稈腐解（Li et al.，2017）。氮素主要抑制真菌生長，而對細菌影響不顯著（Nicolardot et al.，2001；Wang et al.，2003）。研究表明，微生物分解有機物的最適C/N為25∶1，而禾本科作物秸稈的C/N一般都高于最適值，例如小麥莖稈 C/N 可達到 86∶1（Kochsiek et al.，2013）。微生物在腐解秸稈過程中為維持正常的C/N需從外界吸收氮，發生秸稈腐解微生物與植株“爭氮”等現象，因此，補充適量氮素可促進秸稈腐解（李昌明等，2017）。比如通過增施外源氮肥，促進了小麥、玉米等秸稈的腐解（高金虎等，2012；黃婷苗等，2017；張經廷等，2018）。外源增氮可提高纖維素酶等水解酶活性，抑制氧化酶活性，進而影響作物秸稈和凋落物等物質腐解（Keeler et al.，2009；Riggs，2016；Zang et al.，2016）。

秸稈腐熟劑是一種由微生物組成、能夠快速降解秸稈的微生物菌劑，利用真菌、細菌和放線菌的分解代謝作用將秸稈中的纖維素、半纖維素和木質素分解轉化為小分子有機化合物或者產生CO2釋放出來。微生物通過分泌胞外酶促進秸稈的礦化分解（Geisseler et al.，2008），其中水解酶和氧化酶在秸稈腐解過程中起重要作用。前人研究多關注不同腐熟劑種類及其配伍對作物秸稈腐解的影響（胡誠等，2016；丁文成等，2016；陳帥等，2016)，也有研究關注不同通氣、水分、溫度等環境條件下腐解劑對秸稈腐解的影響（Zhang et al.，2016；Sandeep et al.，2016）。有關氮素對秸稈腐解影響的研究多集中在氮素形態轉化及其對作物氮素有效性等方面，但有關氮素和腐解劑組合對作物秸稈腐解的協同作用機理還缺乏深入研究。

本文采用田間堆腐的方法，研究氮素和腐熟劑組合對小麥秸稈腐解的協同作用，分析小麥秸稈堆腐過程中纖維素酶等水解酶和木質素過氧化物酶等氧化酶活性的變化規律；利用偏最小二乘回歸法，分析小麥秸稈腐解速率與小麥秸稈腐解酶活性變化之間的耦合關系，為還田秸稈快速腐解提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試地點：試驗地位于安徽省廬江縣郭河鎮安徽農業大學皖中綜合試驗站（31°25′N，117°09′E），試驗地土壤類型為黃棕壤發育而來的水稻土，土壤pH 5.30、全氮 1.22 g·kg-1、堿解氮 87.55 mg·kg-1、速效磷 12.92 mg·kg-1、速效鉀 266.01 mg·kg-1。

供試秸稈，為冬小麥秸稈，全碳含量40.42%、全氮0.82%、全磷0.10%、全鉀1.30%、C/N 49.29。氮肥為尿素（46%），購自上海蘇懿化學試劑有限公司；秸稈腐解劑由中國農業科學院農業區劃研究所研制的有機物料腐熟菌劑（除臭型），有效活菌數0.5×108ind·g-1。

1.2 試驗設計與樣品采集

秸稈堆腐試驗于2017年6－10月在供試地點進行。將收獲小麥秸稈烘干后剪成3 cm，取20.0 g放入 100目尼龍網袋，尼龍網袋規格為 30 cm×50 cm，扎口后平攤放置在秸稈條垛中（條垛長3 m、寬2 m、高1 m），條垛四周開有排水溝，接受自然條件下的日曬雨淋。

試驗共設置：（1）秸稈自然堆腐（Straw composting，S）；（2）秸稈氮肥堆腐（Nitrogen plus straw composting，NS）；（3）腐解劑堆腐（Effective microorganisms plus straw composting，ES）；（4）氮肥腐解劑堆腐（Nitrogen and effective microorganisms plus straw composting，NESS）等4個處理，每個處理設置3個重復，共埋60個尼龍網袋，每個處理埋12個網袋分5個時間段無放回采集。NS處理添加0.20 g尿素；ES處理添加0.20 g腐熟劑；NESS處理添加0.20 g尿素和0.20 g腐熟劑（李慶康等，2001；潘劍玲等，2013）。在小麥秸稈堆腐試驗開始后的7、15、30、70和120 d采集堆腐秸稈，每個小區（5 m×10 m）隨機取3個尼龍網袋，裝入無菌自封袋中并迅速帶回實驗室，將樣品分成兩部分，一部分秸稈烘干稱重用于理化性質分析，另一部分秸稈保存在4 ℃冰箱，用于酶活性測定。

1.3 堆腐過程質量損失測定

每次取樣時隨機從秸稈條垛堆中選取 3個網袋，用水沖洗網袋粘附的泥漿，在75 ℃下烘干（鮑士旦，2002），稱重，計算秸稈質量殘留率：

式中，Rsr為秸稈殘留率；M0為秸稈原始干重（g）；Mt為腐解t d后的秸稈干重（g）；t為腐解時間（d）。小麥秸稈腐解規律參照 Olson（1963）的理論，利用一階指數衰退模型進行擬合：

式中，W0為初始秸稈質量（g）；Wt為腐解t d后秸稈殘余質量（g）；k為腐解常數；t為腐解時間（d）。

1.4 酶活性測定方法

1.4.1 β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，GC）活性的測定方法

β-葡萄糖苷酶活性采用DNS法測定（Martins et al.，2008），利用 β-葡萄糖苷酶分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400 nm有最大吸收峰，通過測定吸光值來計算β-葡萄糖苷酶活性。酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘產生1 nmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活性單位，即為 nmol·min-1·mg-1。

1.4.2 秸稈纖維素酶（Cellulase，CL）活性的測定方法

纖維素酶活性采用蒽酮比色法（Martins et al.，2008）測定。分析纖維素酶催化羧甲基纖維素鈉降解產生的還原糖的含量。酶活的定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產生 1 μg葡萄糖所需的酶量定義為 1 個酶活力單位，即為 μg·min-1·mg-1。

1.4.3 秸稈中性木聚糖酶（Neutral Xylanase，NEX）活性的測定方法

木聚糖酶活性采用DNS法測定（Yang et al.，2015）。中性木聚糖酶在中性環境中催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下進一步與3, 5-二硝基水楊酸發生顯色反應，在540 nm處有特征吸收峰，反應液顏色的深淺與酶解產生的還原糖量成正比，通過測定反應液在540 nm吸光值增加速率，可計算中性木聚糖酶活力。酶活定義：50 ℃，pH 6.0條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產生1 nmol還原糖所需的酶量為1個中性木聚糖酶的活力單位，即為 nmol·min-1·mg-1。

1.4.4 秸稈木質素過氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）活性的測定方法

木質素過氧化物酶活性采用藜蘆醇氧化速率法（Yadav et al.，2012）測定。木質素過氧化物酶氧化藜蘆醇生成藜蘆醛，在310 nm處有特征吸收峰。酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol藜蘆醇所需的酶量為 1個酶活力單位（U），即為nmol·min-1·mg-1。

1.4.5 秸稈錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）活性的測定方法

錳過氧化物酶活性采用愈創木酚氧化速率法（Anderson et al.，2010）測定。錳過氧化物酶在Mn2+存在的條件下，將愈創木酚氧化成四鄰甲氧基連酚，在465 nm有特征吸收峰。酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol愈創木酚所需的酶量為1個酶活力單位，即為 nmol·min-1·mg-1。

1.4.6 秸稈漆酶（Laccase，LA）活性的測定方法

漆酶活性采用ABTS 法（Ling et al.，2015）測定。漆酶分解底物ABTS產生ABTS自由基，在420 nm 處的吸光系數遠大于底物 ABTS，測定 ABTS自由基的增加速率，可計算得漆酶活性。酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol底物ABTS所需的酶量為 1 個酶活力單位，即為 nmol·min-1·mg-1。

1.5 數據處理

數據的多重比較采用Duncan法分析（P＜0.05），差異顯著性檢驗（ANOVA）采用SPSS 19.0軟件分析。質量損失與多個酶活性的相關性采用偏最小二乘法（PLS）。

2 結果與分析

2.1 不同處理下小麥秸稈的質量變化

小麥秸稈在不同處理條件下的質量殘留量均隨培養時間延長呈逐漸降低趨勢，且均表現為前期下降快，后期下降慢的規律（圖1）。在試驗開始的前30 d內，NS、ES和NESS處理的小麥秸稈質量迅速降低，與 S處理相比達到顯著性差異水平（P＜0.05）。培養至70 d時，NS、ES和NESS處理的小麥秸稈質量殘留率分別為 29.84%、32.04%和25.01%，分別比 S處理多降解了3.95%、1.76%和8.78%。培養至120 d時，小麥秸稈在NS、ES和NESS處理的質量殘留率分別為25.30%、26.74%和20.84%，即在培養的70－120 d內，ES處理的小麥秸稈腐解快于 NS處理，NESS處理的小麥秸稈腐解率高于NS和ES處理。

圖1 小麥秸稈質量變化規律Fig. 1 Mass change regularity of wheat straw

表1 不同處理條件下小麥秸稈質量殘留與堆腐時間關系的擬合Table 1 Regression models of the wheat straw residual quantity and composting time under different treatments

小麥秸稈殘留質量隨時間變化可用一階指數衰退模型[Wt=W0×exp(-kt)]進行擬合（表 1），相關性較高（R2＞0.80）。堆腐結束時（120 d），NS、ES和 NESS 3種處理條件下秸稈腐解率分別為74.70%、73.26%和 79.83%；腐解速率常數k分別為 14×10-3·d-1、14×10-3·d-1和 17×10-3·d-1。這說明氮肥和腐熟劑同時添加更有利于小麥秸稈腐解（P＜0.05）。

2.2 小麥秸稈腐解過程中胞外酶活性的變化

如圖2所示，β-葡萄糖苷酶活性在不同處理中均隨培養時間延長呈先增加而后降低的趨勢。β-葡萄糖苷酶活性在純秸稈處理中（S）以培養至30 d時活性最高，為15.50 nmol·min-1·mg-1；在 NS 處理中以培養至 7 d時活性最高，為 20.44 nmol·min-1·mg-1；在 ES 處理中以培養至 70d 時活性最高，為 29.69 nmol·min-1·mg-1，分別比 S 和 NS處理時的酶活性提高65.59%和63.45%。NESS處理的β-葡萄糖苷酶活性以培養至70 d時活性最高，為23.49 nmol·min-1·mg-1，分別比 S 和 NS 處理時的酶活性提高56.51%和53.80%，比ES下降了20.88%。培養至120 d時，β-葡萄糖苷酶活性以NS處理的最高，達 14.32 nmol·min-1·mg-1，分別比 S、ES 和 NESS高31.96%、22.17%和51.10%。

圖2 小麥腐解過程中酶活性的變化Fig. 2 Changes of enzyme activity during decomposing

纖維素酶活性在不同處理中均隨培養時間延長呈現先降低后升高的趨勢。纖維素酶活性在純秸稈處理中（S）以培養至120 d時活性最高，為16.77 μg·min-1·mg-1；在 NS 處理中以培養至 120 d 時活性最高，為 17.66 μg·min-1·mg-1；在 ES 處理中以培養至 70 d 時活性最高，為 16.46 μg·min-1·mg-1，分別比S和NS處理時的酶活性提高9.12%和33.30%。NESS處理的纖維素酶活性以培養至70 d時活性最高，為 15.49 μg·min-1·mg-1，分別比 S 和 NS 處理時的酶活性提高 3.45%和 29.13%；比 ES下降了5.88%。培養至120 d時，纖維素酶活性以NS處理的最高，達 17.66 μg·min-1·mg-1，分別比 S、ES 和NESS高5.06%、26.23%和12.84%。

中性木聚糖酶活性在不同處理中均隨培養時間延長呈現先升高后降低的趨勢。中性木聚糖酶活性在純秸稈處理中（S）以培養至30 d時活性最高，為 1.71 nmol·min-1·mg-1；在 NS 處理中以培養至 15 d 時活性最高，為 0.82 nmol·min-1·mg-1；在 ES 處理中以培養至 7 d時活性最高，為 1.14 nmol·min-1·mg-1，分別比 S 和 NS 處理時的酶活性提高70.62%和47.30%。NESS處理的中性木聚糖酶活性以培養至 15 d時活性最高，為 1.33 nmol·min-1·mg-1；分別比 S、NS 和 ES 處理時的酶活性提高71.80%、38.55%和23.87%。培養至120 d時，中性木聚糖酶活性以NESS處理最高，達0.69 nmol·min-1·mg-1，分別比 S、NS 和 ES 高 15.33%、70.39%和47.42%。

木質素過氧化物酶活性在不同處理中均隨培養時間延長呈現逐漸降低的趨勢。木質素過氧化物酶活性在純秸稈處理中（S）以培養至120 d時活性最高，為 80.88 nmol·min-1·mg-1；在 NS 處理中以培養至 30 d 時活性最高，為 59.39 nmol·min-1·mg-1；在 ES處理中以培養至 7 d時活性最高，為 89.76 nmol·min-1·mg-1，分別比 S 和 NS 處理時的酶活性提高55.50%和86.38%。NESS處理的木質素過氧化物酶活性以培養至 7 d時活性最高，為 69.52 nmol·min-1·mg-1；分別比 S 和 NS 處理時的酶活性提高42.55%和82.41%；比ES下降了22.55%。培養至120 d時，木質素過氧化物酶活性以S處理的最高，達 80.88 nmol·min-1·mg-1，分別比 NS、ES和NESS高92.64%、56.68%和83.76%。

錳過氧化物酶活性在不同處理中均隨培養時間延長呈現先升高后降低的趨勢。錳過氧化物酶活性在純秸稈處理中（S）以培養至70 d時活性最高，為 6.85 nmol·min-1·mg-1；在 NS 處理中以培養至 120 d 時活性最高，為 10.25 nmol·min-1·mg-1；在 ES 處理中以培養至 30 d時活性最高，為 12.34 nmol·min-1·mg-1；分別比 S 和 NS 處理時酶活性提高65.09%和71.72%。NESS處理的錳過氧化物酶活性以培養至 30 d活性最高，為 17.99 nmol·min-1·mg-1；分別比 S、NS 和 ES 處理時的酶活性提高76.05%、80.60%和31.40%。培養至120 d時，錳過氧化物酶活性以NS處理的最高，達10.25 nmol·min-1·mg-1，分別比 S、ES 和 NESS 高 90.50%、72.13%和24.93%。

漆酶活性在不同處理中均隨培養時間延長呈現先升高后降低的趨勢。漆酶活性在純秸稈處理中（S）以培養至 30 d時活性最高，為 79.12 nmol·min-1·mg-1；在 NS 處理中以培養至 15 d 時活性最高，為 111.53 nmol·min-1·mg-1；在 ES 處理中以培養至30 d時活性最高，為 324.28 nmol·min-1·mg-1；分別比 S 和 NS 處理時酶活性提高75.60%和65.70%。NESS處理的漆酶活性以培養至 15 d 活性最高，為 447.33 nmol·min-1·mg-1；分別比S、NS和ES處理時的酶活性提高84.80%；75.07%和37.65%。培養至120 d時，漆酶活性以NESS處理的最高，達 53.15 nmol·min-1·mg-1，分別比 S、NS和ES高75.15%、50.81%和43.41%。

2.3 胞外酶活性與秸稈生物量損失的相關性及偏最小二乘回歸分析

小麥秸稈質量損失量和胞外酶活性之間的偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）回歸分析結果顯示（表2），不同處理中胞外酶活性對秸稈腐解作用差異較大。在S處理條件下（R2=0.462），纖維素酶（CL）、錳過氧化物酶（Mnp）和漆酶（LA）活性與小麥秸稈腐解速率（質量損失量）呈正相關，回歸系數分別為0.39、0.43和0.17；而β-葡萄糖苷酶（β-GC）、中性木聚糖酶（NEX）和木質素過氧化物酶（LiP）活性與小麥秸稈腐解速率呈負相關，其回歸系數分別為-0.22、-0.98和-0.34。在NS處理條件下，僅有CL活性與小麥秸稈腐解速率（質量損失量）呈正相關，回歸系數為 0.016；其余酶活性均與小麥秸稈腐解速率呈負相關，回歸系數在-0.033 (MnP)－-0.457 (NEX)之間。在ES處理條件下，僅有CL和MnP活性與小麥秸稈腐解速率（質量損失量）呈正相關，回歸系數分別為 0.327和0.085；其余酶活性均與小麥秸稈腐解速率呈負相關，回歸系數在-0.048 (β-GC)－-0.764 (LiP)之間。在NESS處理條件下，CL和MnP活性與小麥秸稈腐解速率（質量損失量）呈正相關，回歸系數分別為1.945和2.096；其余酶活性均與小麥秸稈腐解速率呈負相關，回歸系數在-0.365 (β-GC)－2.529(LA)之間。

表2 不同處理質量損失量與酶活性的偏最小二乘法回歸分析Table 2 Partial least square regression analysis of quality loss and enzyme activity in different treatments

綜上所述，在S處理條件下，纖維素酶，錳過氧化物酶和漆酶對秸稈腐解的影響較大，且氧化酶（Mnp，LA）回歸系數之和大于水解酶（CL），說明自然堆腐條件下氧化酶比水解酶更能促進秸稈腐解。在NS處理條件下，纖維素酶對秸稈腐解的影響較大，說明氮肥可通過提高纖維素酶活性進而促進秸稈腐解。在ES處理條件下，纖維素酶和錳過氧化物酶對秸稈腐解的影響較大，且水解酶（CL）回歸系數大于氧化酶（Mnp），說明腐熟劑主要通過提高水解酶活性促進秸稈腐解。在NESS處理條件下，纖維素和錳過氧化物酶對秸稈腐解的影響較大，且氧化酶（Mnp）回歸系數大于水解酶（CL），說明氮肥和腐熟劑混合通過提高氧化酶活性促進秸稈腐解。

3 討論

3.1 外源微生物菌劑對麥秸腐解的影響

腐熟劑是含有大量的細菌、霉菌、酵母菌和芽孢稈菌等的高效微生物制劑。研究表明，添加秸稈腐熟劑可以促進作物秸稈腐解，縮短腐解轉化時間（蔡立群等，2014；耿麗平等，2015）。本試驗結果表明，添加腐熟劑顯著提升了小麥秸稈腐解速率，這可能與添加腐熟劑后中性木聚糖酶、木質素過氧化物酶和漆酶活性（P＜0.05）提高有關。PLS結果表明，纖維素酶和錳過氧化物酶對秸稈腐解的影響較大。這可能是因為腐熟劑中的真菌是降解植物細胞壁的分解者，通過分泌纖維素酶等水解酶和錳過氧化物酶等氧化酶使植株凋落物的微孔結構纖維化（Arora et al.，2002；Wiedermann et al.，2017），從而加速秸稈腐解。纖維素酶包含β-葡萄糖苷酶，木聚糖酶等多種水解酶，通過加快秸稈中多糖以及可溶性碳等組分的分解，可提高秸稈腐解速率（Wiedermann et al.，2017）；而錳過氧化物酶可以將Mn2+氧化成更活躍的 Mn3+，Mn3+可以穿透秸稈纖維素內的木質素結構，氧化木質素苯環上的酚醛基團，從而加速木質素的腐解（Wiedermann et al.，2017）。

3.2 外源氮素對麥秸腐解的影響

在小麥秸稈堆腐的120 d內，氮肥能顯著促進小麥秸稈腐解，但腐解后期速率減慢（圖1），這可能是因為在秸稈腐解前期外源氮肥可彌補秸稈固有氮素的不足，氮肥為微生物提供生長所需要的氮元素，促進微生物生長并分泌秸稈β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶，加速了秸稈體內纖維素多糖等可溶性組分的降解。陸地生態系統中，在低氮環境下，微生物在產生胞外酶的過程中需要獲得更多的能量來彌補氮的不足（Rinkes et al.，2016），適量的外源氮可以提高胞外酶活性，從而加快植物凋落物腐解。在秸稈腐解后期，可溶性糖等易降解組分相對含量下降，而木質素等難降解組分相對含量升高，且氮素可與秸稈殘余物中木質素苯環上的酚羥基結合，形成更加穩定的苯胺類物質，從而減緩了秸稈腐解后期的腐解速率（Fog，2010）。

PLS結果顯示，氮肥和腐熟劑同時處理時氧化酶活性與質量損失的相關性也高于腐熟劑單獨處理，說明氮肥和腐熟劑具有共同加速小麥秸稈腐解的協同效應。

4 結論

（1）外源氮肥或腐熟劑均能顯著加速小麥秸稈腐解（質量損失加快），氮肥和腐熟劑組合可以協同促進小麥秸稈腐解。

（2）外源氮肥主要通過提高水解酶活性加速小麥秸稈腐解，而外源腐熟劑主要通過促進氧化酶活性加速小麥秸稈腐解。