方斑東風螺養殖環境中細菌數量變動與環境因子的相關性和主成分分析

凌慧, 趙旺, 王瑞旋, 黃晟, 劉曉靖, 吳開暢, 王江勇,*

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方斑東風螺養殖環境中細菌數量變動與環境因子的相關性和主成分分析

凌慧1, 2, 趙旺1, 王瑞旋1, 黃晟1, 2, 劉曉靖1, 2, 吳開暢1, 王江勇1,*

1. 中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣州 510300 2. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306

該研究采用培養法與熒光顯微計數法對方斑東風螺()養殖水體和底沙的細菌數量進行了調查, 并監測主要環境因子, 包括水溫、鹽度、pH、溶解氧、水體氨氮(NH4+-N)、亞硝酸鹽氮(NO2-N)、底質總氮(TN)、總磷(TP), 旨在掌握方斑東風螺養殖環境中細菌數量變化情況, 并探討細菌數量與環境因子的關系。結果顯示, 東風螺養成期水體總細菌(WTB)、異養菌(WHB)、弧菌(WV)數量分別為: 4.15×104—4.36×106cells·mL–1、4.13×103—9.67×105CFU·mL–1、1.83×102— 1.42×104CFU·mL–1; 底沙中異養細菌(SHB)和弧菌(SV)數量分別為:1.26×106—3.69×107CFU·g–1和6.25×104—2.07×106CFU·g–1; 水體總細菌顯著高于水體及底沙中異養菌及弧菌數。相關性分析結果表明, 水體總細菌數量與溶解氧(<0.01)和亞硝酸鹽氮(<0.05)呈顯著負相關, 與氨氮呈正相關(<0.05); 水體異養菌與鹽度呈顯著正相關(<0.05), 與溶解氧極顯著負相關(<0.01); 水體弧菌數量與溫度呈負相關(<0.05); 底沙弧菌數量與溫度呈極顯著負相關(<0.01), 與鹽度呈顯著正相關(<0.05), 底沙異養菌(SHB)與各環境因子無明顯相關性。主成分分析結果表明, 溫度與溶解氧在該養殖系統中占重要地位, 不同時期環境的主導因子存在差異。

方斑東風螺; 細菌; 環境因子; 相關性; 主成分分析

0 前言

方斑東風螺()是中國東南沿海地區養殖的重要經濟貝類, 因肉質鮮美并具極高的營養價值而廣受歡迎。該品種養殖周期短, 通常為4至6個月, 近十年來, 在養殖規模不斷擴大的同時, 細菌性病害也日漸突出并嚴重制約了整個產業的發展[1, 2]。細菌是海洋環境中最主要的原核生物類群, 是海洋生態系統物質循環及能量轉化的主要承擔者, 特別是在微食物鏈中[3-7]。異養菌在海水養殖生態系統中的作用也不可或缺, 它能直接利用動植物生命活動中及死后分解的各類碎屑、生物大分子及氨基酸等, 是海水養殖環境與生態學研究的重要內容[3]?；【且鸷Ｑ髣游锊『Φ某Ｒ婎惾褐? 普遍存在于環境及動物消化道和體表[8-10]。研究表明, 細菌及環境要素、氣候變化通常是養殖動物發病的主要誘因[6, 11-13], 細菌數量是反映水質狀況的一項重要指標, 且與環境因子存在著密切關系[3, 14-18]。目前, 陸基水泥池鋪沙流水式養殖是方斑東風螺工廠化養殖中主要的方式, 受螺的活動、餌料投喂、環境等的影響, 東風螺養殖環境中各因素間存在著較為復雜的線性及非線性關系, 然而對東風螺養殖環境中的細菌與主要環境因子的關系報道較少。該研究通過調查方斑東風螺養殖水體的總細菌、異養菌、弧菌, 底沙的異養菌、弧菌, 主要水環境因子(水溫、鹽度、pH、溶解氧、氨氮、亞硝酸鹽氮)和底沙營養鹽(總氮、總磷), 研究環境中細菌數量與環境因子間的相關性。應用主成分分析法[19]分析各環境要素在秋冬季養殖期的時間分布特征, 以期為方斑東風螺養殖環境優化調控管理及細菌性病害防控提供基礎性參考。

1 材料與方法

1.1 采樣點概況

試驗在中國水產科學研究院南海水產研究所帶水產研發中心方斑東風螺養殖試驗基地進行, 東風螺苗于2015年7月初投放于試驗池, 考慮到螺苗對環境需要一段適應期, 因此實驗選取在2015年8月1日至2015年12月24日進行監測。試驗池規格為2 m×6.5 m×0.6 m, 共監測2個養殖池。底沙厚度約2—3 cm, 沙粒徑大小約1—2 mm, 養殖池縱向中軸線布置充氣管, 用自然沉淀的海水做流水養殖, 水深約0.5 m, 每日流水量約200%, 24 h充氣。每日下午3點—5點定時給東風螺投喂適量冰鮮小雜魚, 之后將殘余餌料撈出養殖池, 保持養殖環境的潔凈, 養殖期間每間隔5—6天, 于上午9點定時采樣監測一次, 持續監測5個月, 約一個養殖周期。

1.2 樣品采集與處理

用經消毒的簡易采水及采泥器采集養殖池四角及中間位點等量表層以下約0.1 m 深的水及螺生活層底沙, 混勻備用。試驗的檢測項目包括水體溫度、鹽度、pH、溶解氧、氨氮、亞硝酸鹽氮及總細菌、異養菌、弧菌, 底沙總氮、總磷、異養菌、弧菌。

水體異養菌、弧菌計數分別采用2216E瓊脂培養基、TCBS瓊脂培養基(均購自廣東環凱微生物科技有限公司, 廣州)。取混勻的水樣1 mL分別用無菌海水梯度稀釋至10–1、10-2、10-3, 分別取前3個梯度稀釋液100 μL涂布于TCBS平板, 取后3個梯度稀釋液100 μL涂布于2216E平板, 每個梯度分別做3個平行。將接種后的平板置于28℃恒溫培養箱中培養48 h后, 選取平均菌落數在30-300以內為有效, 計數(單位: CFU·mL–1)。水體總細菌采用DAPI熒光染色計數法, 方法參考《海洋調查規范》(GB/T 12763.6—2007)進行測定。水體溫度、鹽度、pH、溶解氧均現場用水質測定儀測定, 氨氮、亞硝酸鹽氮質量濃度的測定均參考《海洋監測規范》(GB 17378.4—2007)進行。

底沙異養菌、弧菌計數分別采用2216E瓊脂培養基、TCBS瓊脂培養基。取混勻的底沙樣品約1 g置于無菌的10 mL離心管中, 加入5 mL無菌海水充分震蕩, 并梯度稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5, 分別取前3個梯度稀釋液100 μL涂布于TCBS平板, 取后三個梯度稀釋液100 μL涂布于2216E平板, 每個梯度分別做3個平行, 培養及計數方法同水體異養菌及弧菌?？偟?、總磷質量濃度的測定均參考《海洋監測規范》(GB 17378.5—2007)。

1.3 數據統計分析

采用相關性分析法研究養殖系統內細菌數量與各環境因子的關系, 結合回歸分析做曲線擬合。應用主成分分析法對養殖系統各環境因子進行降維處理[12, 18, 19], 并通過分類主成分分析研究該養殖系統的主導環境因子。文章使用Excel 2016對數據做初步整理, 并應用SPSS20.0進行單因素方差分析、相關性分析及主成分分析, 細菌數量及環境因子的變化折線圖應用Excel2016繪制; PCA圖主要應用Origin9.1繪制, 并經Adobe Illustrator CS6修改完成。

2 結果與分析

2.1 方斑東風螺養殖環境細菌數量的變化

方斑東風螺養殖環境中細菌數量的變化如圖1。東風螺養成期間, 養殖水體的總細菌數量變化與異養菌、弧菌變化趨勢相似, 水體總細菌、異養菌、弧菌數量變化范圍分別為4.15×104—4.36×106cells·mL–1、4.13×103—9.67×105CFU·mL–1、1.83× 102—1.42×104CFU·mL–1。底沙中的異養菌數量變化為1.26×106—3.69×107CFU·g–1, 弧菌為6.25×104— 2.07×106CFU·g–1, 底沙中的異養菌與弧菌數量變化趨勢相似。

2.2 環境因子的變化

監測期間水體溫度為20.80—31.30 ℃, 8—9月水溫較高, 10—12月水溫呈逐漸下降趨勢, 但基本維持在25℃以上。溶解氧質量濃度為4.96—8.21 mg·L–1, 12月18日出現最大值是由氣溫下降, 大氣壓升高而引起。鹽度變化范圍為30.00—34.15 ppt, 8月13日由強降雨天氣引起鹽度聚降, 但監測未見螺出現不良反應。pH變化范圍為7.46—8.15, 并呈鋸齒狀波動。水體中的氨氮及亞硝酸鹽氮濃度分別為240.60—886.90 μg·L–1、31.43—66.23 μg·L–1, 亞硝酸鹽氮的變化較氨氮小。底沙中的總氮、總磷的變化分別為0.29—0.95 μg·g–1、701.09—3100.7 μg·g–1, 總磷變化較大, 隨著養殖時間的增長, 底沙中總氮、總磷含量不斷升高。

2.3 方斑東風螺養殖環境細菌數量與環境因子的相關性

方斑東風螺養殖系統細菌數量與環境因子的Pearson相關性系數見表1, 水體總細菌數量與溶解氧呈極顯著負相關(<0.01), 與氨氮呈正相關(<0.05)、與亞硝酸鹽氮呈負相關(<0.05)。水體異養菌與鹽度呈顯著正相關(<0.05), 與溶解氧極顯著負相關(<0.01), 與氨氮、總磷等無相關性。弧菌數量與溫度呈負相關(<0.05), 與各環境因子相關性不明顯。底沙弧菌數量與溫度呈極顯著負相關(<0.01), 與鹽度呈顯著正相關。

圖1 方斑東風螺養殖系統細菌數量變化

Figure 1 Changes of bacterial density in theaquaculture system

圖2 養殖系統溫度、溶解氧、鹽度、pH及水體、底沙營養鹽隨時間的變化

Figure 2 Changes of temperature, dissolved oxygen, salinity, pH and major nutritive salt of water and sediment in aquaculture system with time

2.4 方斑東風螺養殖系統的主成分分析及環境要素的分布

應用z-score標準化處理的數據做主成分分析, 經過對KMO值(Kaiser—Meyer—Olkin)的計算, 其值為0.543>0.5, 表明所用數據可用于主成分分析。經Bartlett球形度檢驗, 近似卡方值為143.975,<0.01, 說明因子變量高度相關, 足夠為主成分分析提供合理基礎。主成分分析具體結果如下表所示, 主成分的確定采用特征值大于1的標準, 這樣前五個主成分的方差貢獻率累計達到78.277%。

表1 方斑東風螺養殖系統細菌數量與環境因子的Pearson相關系數

注: *. 顯著性相關(< 0.05); **. 極顯著相關(<0.01)。

2.4.1 養殖系統的主成分分析

方斑東風螺養殖系統環境要素的主成分分析結果見表2, 第一主成分主要表征水體微生物類因子的變動情況及水體溶解氧, 微生物數量的增加及分解有機體需要消耗大量氧氣, 因此溶解氧及氨氮在其中也有占較大權重系數。第二主成分主要表征水體溫度與底沙弧菌數量, 底沙異養菌的權重系數較低, 表明底沙中異養菌數量受溫度的影響較小, 水溫是影響底沙弧菌數量的重要因素之一, 與相關性分析的結果十分吻合。第三主成分主要表征水體中氨氮、亞硝酸鹽氮及pH, 氨氮與亞硝酸鹽氮均占有較高權重系數。第四主成分主要表征底沙總磷與鹽度。第五主成分表征底沙異養菌與總氮。

表2 方斑東風螺養殖系統環境要素的主成分分析

2.4.2 環境要素的分布

通過分類主成分分析法, 對8—12月各監測期在第一、第二主成分的綜合得分與因子載荷做雙標圖(如圖3), 該圖較好的顯示了環境要素在不同時期的分布。8、9、10月溫度及亞硝酸鹽氮對養殖環境的影響較明顯, 成為環境的主導因子, 各監測期主要集中在該兩個環境因素區域。8—10月份外界氣溫偶爾出現急劇變化的情況, 10月為三亞進入秋季, 隨著氣溫逐漸下降, 氣壓升高, 養殖水中溶解氧含量受到較大的影響而成為環境的主要要素, 因此8—10月在圖3第三象限內有較集中的分布。11月份的監測期主要分布于第一象限, 水體中的各類細菌對環境的影響較明顯, 且此期水體各類細菌與營養鹽之間存在較為復雜的關系。12月養殖環境的底沙中異養菌、弧菌及鹽度的變化成為環境的主導要素。

3 討論

細菌是水域生態系統重要的礦化者, 同時也作為初級生產力成為部分微型浮游動物的餌料, 其活躍的代謝促進了系統中的物質循環和能量流動, 維系著一個系統的正常運轉[20]?；【呛Ｑ笊鷳B系統中的重要類群, 廣泛存在于海洋環境中, 且大多數能感染各種水產動物, 是養殖系統內常見的致病菌或條件致病菌, 有研究表明該類細菌數量越高, 病害發生幾率越大[2, 10]。已有學者對粵東深澳灣養殖水體[21]、刺參()養殖水體[12]、凡納濱對蝦()高位養殖池水體[22]的異養菌及弧菌數量做出了相關報道。該研究顯示方斑東風螺養殖水體中異養菌數量為4.13×103— 9.67×105CFU·mL–1, 弧菌數量為1.83×102—1.42× 104CFU·mL–1, 其中異養菌數量與上述的凡納濱對蝦養殖池最為接近, 比刺參養殖池高1—2個數量級; 弧菌數量高于上述報道區域約1—2個數量級; 方斑東風螺養殖池總細菌數量為4.15×104—4.36×106cells·mL–1, 與張喆[7]監測的南海中北部海域秋季浮游細菌數量較接近。東風螺營埋棲生活, 底質環境的好壞直接影響東風螺的健康, 而底沙中異養菌及弧菌數量是反應底質環境的重要指標。監測發現, 方斑東風螺養殖底沙中異養菌及弧菌數量分別為1.26×106—3.69×107CFU·g–1、6.25×104—2.07×106CFU·g–1, 其中異養菌數量比已報道的刺參養殖池塘表層沉積物[12]、粵東深澳灣網箱養殖區底泥[21]、象山港大黃魚網箱養殖區及周圍海域沉積物[23]高2—3個數量級, 底質中弧菌數量比上述區域分別高1—3個數量級。由以上結果可以看出, 相比其他物種的養殖環境, 方斑東風螺養殖底質中異養菌及弧菌數量較高, 預示著該品種在養殖過程中病害發生的風險可能更大, 這主要是由東風螺養殖的底質類型、養殖動物食性與活動、養殖模式等決定。在調查中還發現, 高溫季節期間東風螺養殖池壁有生物膜出現, 該生物膜可能是微生物受到刺激而產生的對環境的適應, 環境中細菌數量偶爾整體下降, 可能與該生物膜形成有關。

注: 1.圖中字母表示月份(A、S、O、N、D分別表示8、9、10、11、12月), 數字表示該月監測的次序; 2.向量長度的平方表示該變量的方差貢獻, 各對象的坐標表示該對象在第一、二主成分的綜合得分, 從一個對象向分量載荷向量作垂線, 交點的數值就是該對象在該變量上的表現值。

Figure 3 The spot of the first and second principal component scores and environmental factor loading

方斑東風螺工廠化養殖池是一個由養殖水體、養殖生物及其底沙棲息環境共同組成的半開放式復合生態系統, 在一定程度上受外界氣候變化等的影響。溫度及溶解氧是養殖系統中兩項重要水質指標, 二者的變化能導致其他環境因子的變化。水中游離氧還參與銨鹽轉化為硝酸鹽及其他氧化還原過程, 與鹽度、亞硝酸鹽氮、氨氮等均存在一定的聯系, 并共同影響著養殖系統中微生物數量變化。非生物因素及生物因素均會影響細菌增長, 環境中有機碳、營養鹽及微量元素等是細菌生長代謝的必要營養條件, 而原生動物的捕食、噬菌體的感染等也會引起細菌數量減少[24-26]。已有研究發現, 超微型原生動物能明顯抑制細菌的增長, 且溫度越高, 超微型原生動物的捕食作用及細菌生長率均明顯提高[27]。細菌及其捕食者均有生長周期, 一些攝食者的生長周期落后于細菌, 因此細菌的增長率并不固定[28]。該研究中, 養殖水體的氨氮、亞硝酸鹽氮含量分別為240.60—886.90 μg·L–1、31.43—66.23 μg·L–1, 底沙總氮、總磷含量分別為0.29—0.95 μg·g–1、701.09— 3100.70 μg·g–1, 比專家們對高位池養殖水[3]、鮑養殖水體[18]、大鵬澳養殖區柱狀沉積物[29]等的營養鹽檢測結果均低。溫度是影響細菌生長的重要環境因子, 但是在不同海區、不同季節的生態系統中, 水溫對細菌分布的作用有所不同[30]。該研究結果顯示弧菌數量與溫度呈負相關, 總細菌數量與氨氮呈正相關、與亞硝酸鹽氮負相關, 而其他營養鹽與異養菌、弧菌等均無明顯相關性。根據以上結果, 推測方斑東風螺工廠化養殖中營養鹽含量可能是異養細菌及弧菌等細菌增長的限制因子, 此外微型浮游動物可能對細菌存在較大的捕食壓, 在長期的高溫、營養匱乏和捕食壓力下, 細菌可能出現大量死亡或形成菌膜附著于養殖池壁及沙質表面。該研究中溫度與水體、底沙中弧菌數量呈現負相關關系, 與該地區水體溫度分布差異較小等有關。水溫差異較小導致細菌豐度差異不明顯, 二者關系被削弱, 長期的高溫條件增強了底沙及水體中原生動物等對細菌的捕食及噬菌體的感染活動, 使環境中細菌數量減少, 削弱了細菌與溫度及其他營養鹽的關系。

環境本身是一個相互作用的系統, 任何一個養殖系統的生態因子都不是孤立存在, 而是彼此聯系, 共同影響整個養殖生態系統及其表觀參數。本研究結果表明, 水體溶解氧和溫度在該養殖系統的環境要素中占較重要的地位, 二者分別在第一、二主成分中有較高的權重系數, 水環境中的細菌及底沙中的弧菌與其均存在較為密切的關系。此外, 養殖系統的主導因子隨氣候的變化而變化。溫度與亞硝酸鹽氮在夏秋季(8、9、10月)是主要的環境因素, 至11月份, 水體中的細菌成為主要因子。11—12月也是海南地區東風螺病害多發期之一, 該月份是氣溫變化的時期, 致使水體溶解氧也出現一定的變化, 水體及底沙中細菌活動旺盛, 加快了殘余餌料等有機質的分解代謝, 水體中的氨氮、底沙中的總氮在該月份均出現最大值, 總磷也居高不下。12月份時, 水體鹽度及pH、底沙中弧菌及異養菌數量已然成為環境的主導因素, 對東風螺病害的防控極為重要。

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The quantity variation of bacteria inaquaculture environ-ment and its correlation and principal component analysis

LING Hui1, 2, ZHAO Wang1, WANG Ruixuan1, HUANG Sheng1, 2, LIU Xiaojing1, 2, WU Kaichang1, WANG Jiangyong1,*

1. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Guangzhou 510300, China 2. College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

Heterotrophic bacteria and vibrio quantity inaquaculture system ofwere measured by cultivation method, and total bacteria in water(WTB)were measured by fluorescence microscopy. In addition, we investigated the main environmental factors including temperature, salinity, pH, dissolved oxygen and major nutritive salt of water and sediment, for the aim to determine the relationship between bacterial quantity and environmental factors. The results showed that the quantity of WTB was 4.15 × 104to 4.36 × 106cells·mL–1, that of heterotrophic bacteria of water(WHB) was 4.13×103to 9.67×105CFU·mL–1and of sediment (SHB) was 1.26×106to 3.69×107CFU·g–1, that ofof water(WV) was 1.83×102to 1.42×104CFU·mL–1andof sediment (SV) was 6.25×104to 2.07×106CFU·g–1.Correlation analysis results showed that the quantity of WTB was negative correlation with both dissolved oxygen (< 0.01) and nitrite (<0.05), and positively correlated with ammonia nitrogen (<0.05). WHB was positive correlation with salinity (<0.05) and negative correlation with dissolved oxygen (< 0.01). WV was negative correlation with temperature (<0.05), and others were not obvious. Quantity of SV was negative correlation with temperature (< 0.01) and positive correlation with salinity (<0.05). The correlations of SHB with environment factors were inconspicuous. Principal component analysis (PCA) showed that the temperature and dissolved oxygen played important roles in the farming system and the dominant factors of environment differed in different periods.

; bacteria; environmental factors; correlation; principal component analysis

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.02.017

S 968. 31+5

A

1008-8873(2019)02-130-08

2017-01-17;

2017-04-06

現代農業產業技術體系建設專項資金-貝類產業技術體系科學家崗位專項經費項目(CARS-48); 中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(中國水產科學研究院南海水產研究所)資助項目(2015YD04); 廣東省漁港建設和漁業產業發展專項(海洋漁業科技推廣方向-科技攻關與研發項目(A201601B11); 海南省應用技術研發與示范推廣專項(ZDXM2015058); 海南省自然科學基金項目(314180, 20153170); 三亞市農業科技創新項目(2015KJ05)。

凌慧(1991—), 女, 湖南衡陽人, 碩士研究生, 從事海水貝類病害研究, E-mail: Lingh156@163.com

王江勇(1970—), 男, 湖南新寧人, 博士, 研究員, 從事海水貝類病害研究, E-mail: wjy104@163.com

凌慧, 趙旺, 王瑞旋, 等. 方斑東風螺養殖環境中細菌數量變動與環境因子的相關性和主成分分析[J]. 生態科學, 2019, 38(2): 130-137.

LING Hui, ZHAO Wang, WANG Ruixuan,et al. The quantity variation of bacteria inaquaculture environment and its correlation and principal component analysis[J]. Ecological Science, 2019, 38(2): 130-137.