耐碳青霉烯類腸桿菌科(CRE)耐藥分子機(jī)制及控制流行的應(yīng)對(duì)策略*

張艷雙，劉 靜，萬 楠，欒 亮

(中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，沈陽 110000)

多重耐藥菌(MDROs)的流行在現(xiàn)今是一種主要的公共衛(wèi)生安全威脅，在全球范圍內(nèi)持續(xù)增加，且與發(fā)病率、死亡率存在顯著的相關(guān)性。腸桿菌科細(xì)菌作為革蘭陰性菌(GNB)家族中最常見的病原菌，可在各種社區(qū)和醫(yī)療保健環(huán)境中造成獲得性感染。在GNB中，抗性的主要驅(qū)動(dòng)力是β-內(nèi)酰胺酶(由bla編碼)，β-內(nèi)酰胺酶是一種快速擴(kuò)展的β-內(nèi)酰胺水解酶，其目前編碼的蛋白質(zhì)序列的數(shù)量已超過2 100。除此之外，這些微生物病原菌還可以攜帶額外的質(zhì)粒基因，對(duì)抗其他類別的抗生素，從而使細(xì)菌對(duì)多種藥物具有抗性。

近幾年，長期大量、不規(guī)范合理使用碳青霉烯類抗生素導(dǎo)致對(duì)其耐藥的腸桿菌科細(xì)菌的產(chǎn)生呈飛速發(fā)展的趨勢(shì)，在世界范圍內(nèi)越來越流行。而腸桿菌科細(xì)菌中又以肺炎克雷伯菌最為明顯。作為最后一道防線的碳青霉烯類藥物越來越多地受到含有碳青霉烯酶耐藥基因和其他耐藥基因移動(dòng)遺傳元件的挑戰(zhàn)[1]。隨著抗藥性分子機(jī)制不斷發(fā)展，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的流行病學(xué)也發(fā)生著變化，全世界越來越多的人正在受到這些危險(xiǎn)微生物的影響。

1腸桿菌耐碳青霉烯的分子機(jī)制對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制主要有兩種：①β-內(nèi)酰胺酶活性與結(jié)構(gòu)突變；②產(chǎn)生碳青霉烯酶，即水解碳青霉烯類抗生素的酶。前一種機(jī)制包括由質(zhì)粒編碼的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC)，其在腸桿菌科細(xì)菌中的表達(dá)通常與誘導(dǎo)型或去抑制型的染色體基因的酶過量產(chǎn)生有關(guān)。ESBLs和AmpC能夠與孔蛋白的突變相結(jié)合，所述的孔蛋白是GNB外膜蛋白質(zhì)的一個(gè)突變體，當(dāng)改變或丟失時(shí)，可以延緩抗生素到足夠慢的速率在細(xì)菌膜上的擴(kuò)散，以促進(jìn)ESBL和AmpC酶的作用[2]。與GNB中碳青霉烯抗性相關(guān)的其他機(jī)制還包括藥物外排泵和青霉素結(jié)合蛋白的改變。

碳青霉烯酶因可水解碳青霉烯類抗生素而導(dǎo)致耐藥，其按分子結(jié)構(gòu)可分為A，B，D三類(見表1)，A類和D類碳青霉烯酶其活性部位均需要絲氨酸，而B類金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)需要鋅來進(jìn)行β-內(nèi)酰胺水解。值得注意的是A類碳青霉烯酶基因包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)、圭亞那擴(kuò)展譜(GES)、亞胺培南耐藥(IMI)、非金屬碳青霉烯酶(NMC)、黏質(zhì)沙雷氏菌酶(SME)和沙雷氏菌碳青霉烯酶(SFC)。在A類中，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)在臨床和流行病學(xué)上是最重要的，主要通過醫(yī)療保健中設(shè)施克隆暴發(fā)傳播[3-4]。

表1 碳青霉烯酶的分類

KPC能夠水解所有β-內(nèi)酰胺，含有blaKPC的菌株通常具有對(duì)氟喹諾酮類、氨基糖苷類和甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑耐藥，從而產(chǎn)生MDROs。產(chǎn)KPC的腸桿菌科細(xì)菌的國際傳播主要是由于屬于克隆復(fù)合體258(CC258)的肺炎克雷伯菌菌株的克隆擴(kuò)增，這些歸因于blaKPC-2或blaKPC-3的多位點(diǎn)序列型ST258菌株的克隆擴(kuò)增。多位點(diǎn)序列型ST258肺炎克雷伯菌菌株包含2個(gè)不同的遺傳進(jìn)化枝(I和II)，并且已發(fā)現(xiàn)幾種其他序列類型攜帶blaKPC，其與多種質(zhì)粒相關(guān)[5]。此外，產(chǎn)生KPC的菌株具有低至高水平的碳青霉烯抗性，相應(yīng)的最小抑制濃度范圍從易感到>16 μg/ml，與blaKPC基因拷貝數(shù)增加、blaKPC基因正上游缺失和/或外膜孔蛋白損失(OmpK35和/或OmpK36)有關(guān)。

B類金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)是一組復(fù)雜的酶，可以水解所有β-內(nèi)酰胺類，保留單環(huán)內(nèi)酰胺，并且不受β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的抑制。它們與鋅對(duì)β-內(nèi)酰胺水解的要求不同于絲氨酸碳青霉烯酶。因此，它們的活性受到金屬螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)的抑制。腸桿菌科細(xì)菌中還需要注意的是可傳播MBL基因包括IMP(對(duì)亞胺培南有活性)，VIM(維羅納整合子編碼的MBL)和NDM(新德里MBL)[6]。VIM型和IMP型MBL最常嵌入I類整合子中，并與轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒相關(guān)，這有利于傳播。

NDM型碳青霉烯酶為B類碳青霉烯酶，于2008年首次在瑞典人身上分離的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)。之后NDM型碳青霉烯酶在世界各地均有報(bào)道。盡管產(chǎn)生NDM的腸桿菌科細(xì)菌的快速傳播類似于產(chǎn)生KPC的腸桿菌科細(xì)菌，但NDM型MBL的傳播似乎與主要的克隆菌株無關(guān)，并且由不同的質(zhì)粒不相容性(Inc)類型介導(dǎo)。目前理論上，腸桿菌科細(xì)菌中最常見的循環(huán)NDM β-內(nèi)酰胺酶基因(blaNDM-1)是從鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)化而來的。blaNDM-1基因上游的完整或變異插入序列ISAba125，包含blaNDM的鮑曼不動(dòng)桿菌和腸桿菌科細(xì)菌，以及blaNDM屬與bleMBL的相似共表達(dá)[7-8]。

D型OXA β-內(nèi)酰胺酶在不動(dòng)桿菌屬中發(fā)現(xiàn)具有水解苯唑西林的能力，在腸桿菌科細(xì)菌中越來越多，特別是OXA-48變體[9-10]。與產(chǎn)生OXA-48的腸桿菌科細(xì)菌傳播相關(guān)的骨架最常見的是IncL/M型質(zhì)粒，其通過獲得Tn1999復(fù)合轉(zhuǎn)座子整合了blaOXA-48基因。OXA-48酶水解青霉素水平較高，水解碳青霉烯水平較低。此外菌株可能表達(dá)多種ESBLs，使它們對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類具有抗性。

2控制醫(yī)療保健環(huán)境中CRE菌株流行的應(yīng)對(duì)策略

2.1 強(qiáng)化醫(yī)療環(huán)境管理 CRE菌株引起相關(guān)感染的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)顯著增加，給國家造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和極大的社會(huì)危害，已成為重大公共衛(wèi)生難題。因此，地方、區(qū)域和國家都需要積極采取預(yù)防措施來控制CRE的傳播。

醫(yī)療環(huán)境中，不斷強(qiáng)化醫(yī)療環(huán)境管理來控制CRE菌株的傳播十分關(guān)鍵。在門診醫(yī)療環(huán)境中，應(yīng)當(dāng)重視篩查CRE感染的高危人群，逐漸建立CRE感染的篩查措施。對(duì)感染及攜帶的患者需隔離處理，特別是患有引流傷、尿失禁或具有其他傳播危險(xiǎn)因素的患者，在訪問后應(yīng)對(duì)檢查區(qū)域進(jìn)行全面清潔。通過加強(qiáng)環(huán)境消毒、阻斷接觸傳播來加強(qiáng)醫(yī)院感染防控措施。而對(duì)于病房醫(yī)療環(huán)境的管理，我們建議CRE陽性患者每天至少清潔和消毒一次房間，并盡可能使用專用的或一次性設(shè)備。在轉(zhuǎn)移CRE陽性患者后，應(yīng)對(duì)房間及其內(nèi)容物和浴室進(jìn)行徹底清潔和消毒，包括隱私窗簾、床墊等[11]。CRE被認(rèn)為是導(dǎo)致設(shè)備器械相關(guān)感染的主要原因。導(dǎo)尿管(IDC)、動(dòng)靜脈導(dǎo)管、氣管內(nèi)導(dǎo)管和植入性的留置裝置等均可以通過提供表面以便病原體黏附和生物膜的發(fā)展來促進(jìn)感染的發(fā)生。因此，最大限度地減少、限制侵入性設(shè)備的使用是CRE預(yù)防的一項(xiàng)重要干預(yù)措施。患者必須具有使用侵入性設(shè)備的適應(yīng)癥，同時(shí)使用過程中要嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，并在治療結(jié)束時(shí)盡快移除設(shè)備。 除此之外，在醫(yī)療設(shè)備的管理中，醫(yī)院要必須明確設(shè)備表面清潔和消毒的責(zé)任和頻率，并監(jiān)督合規(guī)性。

2.2 加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生教育 醫(yī)務(wù)人員在醫(yī)療環(huán)境中CRE的流行傳播中扮演著重要角色。通常通過醫(yī)護(hù)人員的手，導(dǎo)致醫(yī)療環(huán)境中患者與患者之間耐藥菌株的傳播，也是導(dǎo)致MDROs發(fā)病率和流行率增加的主要因素。因此，必須加強(qiáng)設(shè)施內(nèi)的手部衛(wèi)生管理，重點(diǎn)是醫(yī)護(hù)人員的手衛(wèi)生教育。對(duì)醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行有關(guān)手衛(wèi)生和接觸預(yù)防措施的教育和培訓(xùn)，是確保正確理解和實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的傳播預(yù)防措施的先決條件。所有的醫(yī)療機(jī)構(gòu)都必須能夠方便地使用手衛(wèi)生設(shè)施。

2.3 全面提高實(shí)驗(yàn)室能力水平 診斷實(shí)驗(yàn)室對(duì)感染控制和公共衛(wèi)生的貢獻(xiàn)往往被低估和資金不足。國家應(yīng)確保當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室具有利用國際公認(rèn)的方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)的能力，對(duì)CRE的檢測(cè)和數(shù)據(jù)報(bào)告的最低測(cè)試要求應(yīng)達(dá)成一致，并定期進(jìn)行質(zhì)量保證。

應(yīng)發(fā)布統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)室指南，用于篩選腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥性以及產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE分離株的表型和分子檢查。現(xiàn)如今微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌常用的有表型檢測(cè)方法如紙片擴(kuò)散法(K-B法)、改良Hodge試驗(yàn)(MHT)、Carba-NP試驗(yàn)、EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)等以及通過分子生物學(xué)技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)、傳統(tǒng)PCR，實(shí)時(shí)PCR等檢測(cè)相應(yīng)耐藥基因來確定[12]。由于這些生物體具有不同的流行潛力，微生物實(shí)驗(yàn)室必須能夠?qū)a(chǎn)生碳青霉烯酶的CRE分離株與其它碳青霉烯抗性機(jī)制區(qū)分開來。現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，產(chǎn)生碳青霉烯酶(CP)的腸桿菌科細(xì)菌比非產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌具有更大的傳播潛力。此外，blaOXA-48可以成功地水平傳播并具有強(qiáng)大的流行潛力。因此，提高實(shí)驗(yàn)室的診斷能力對(duì)于遏制CRE菌株的傳播有重要的意義。

2.4 合理有效的抗菌方案是治療CRE感染的關(guān)鍵 由于不規(guī)范合理應(yīng)用抗生素以及對(duì)CRE引起嚴(yán)重感染缺乏可用有效的治療方案，導(dǎo)致耐藥菌的流行傳播。其中最常見的問題就是醫(yī)院獲得性肺炎(HAP)和呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(VAP)。因此，應(yīng)審查感染治療的指南，以確保提供廣譜藥物的替代品，并強(qiáng)調(diào)抗生素的降級(jí)和減少特定抗生素類別和總抗生素的負(fù)擔(dān)，制定有效的治療方案。

2.4.1 抗生素的應(yīng)用：多黏菌素在1947首次發(fā)現(xiàn)，隨后被廣泛應(yīng)用在革蘭陰性菌引起的全身感染的治療。但因其耳腎毒性等缺陷，被一些新的廣譜抗生素逐漸取代。因而近20年的時(shí)間里，多黏菌素的使用僅限于眼科和局部用藥，全身或霧化的多黏菌素僅用于囊性纖維化和燒傷患者。21世紀(jì)以來，由多重耐藥的革蘭陰性菌引起的感染增多，尤其是CRE引起的嚴(yán)重感染的出現(xiàn)，比如產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯桿菌和NDM-1(新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶)的腸桿菌科細(xì)菌等等。因?yàn)樘婕迎h(huán)素和多黏菌素類藥物對(duì)其相對(duì)敏感，所以在某些情況下多黏菌素成為治療CRE引起嚴(yán)重感染的最后一道防線。其治療機(jī)制為帶正電荷的多黏菌素陽離子多肽在液體環(huán)境下與革蘭陰性菌細(xì)胞外膜中帶負(fù)電荷的類脂A發(fā)生靜電結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌的細(xì)胞外膜破壞，促使細(xì)胞中如核苷酸、氨基酸等重要組分被暴露，從而抑制細(xì)菌生長或?qū)е录?xì)菌死亡[13]。

在經(jīng)驗(yàn)性治療方面，對(duì)于懷疑CRE導(dǎo)致的嚴(yán)重感染患者，可使用多黏菌素增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，同時(shí)還可以應(yīng)用磷霉素干擾細(xì)胞壁合成或氨基糖苷類、替加環(huán)素等抑制蛋白質(zhì)合成，以充分降低最小抑菌濃度。但多黏菌素的肺穿透性差，碳青霉烯類和磷霉素可以彌補(bǔ)這一缺陷，從而使其在肺部達(dá)到臨床最佳濃度。

CRE重癥感染患者其死亡風(fēng)險(xiǎn)高，因此針對(duì)CRE重癥感染的患者推薦使用聯(lián)合方案[14]。在治療CRE重癥感染的眾多聯(lián)合方案中，含碳青霉烯聯(lián)合方案可有效改善CRE感染患者預(yù)后。2009～2010年開展的一項(xiàng)觀察性研究顯示，含≥2種有活性抗生素治療方案(尤其含碳青霉烯方案)，可以顯著降低CRE血流感染患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)碳青霉烯MIC≤8 mg/L時(shí)，其聯(lián)合有活性抗生素治療CRE血流感染患者，28天全因死亡率僅19.3%，遠(yuǎn)低于碳青霉烯聯(lián)合無活性抗生素全因死亡率(58.3%)。

2.4.2 臨床新藥的開發(fā)：CRE的廣泛流行給全球帶來日益嚴(yán)重的威脅，因而迫切需要研發(fā)新型的抗生素。最近，美國食品藥品管理局批準(zhǔn)了兩個(gè)新的抗生素組合，即頭孢他洛林-他唑巴坦和頭孢他啶-阿維巴坦。

頭孢洛林作為第五代頭孢菌素類抗生素，其機(jī)制是與細(xì)菌細(xì)胞壁上的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)合抑制肽聚糖合成導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)異常進(jìn)而使細(xì)菌溶解或死亡，因此對(duì)革蘭陽性菌有強(qiáng)大的抗菌作用。此外，其還可與青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP-2a)有效結(jié)合，PBP-2a常不易與臨床應(yīng)用的β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合。因此，頭孢洛林可以憑借其與PBP-2a結(jié)合的特性對(duì)包括MRSA在內(nèi)的菌株均具有有效的抗菌活性，優(yōu)于其他β-內(nèi)酰胺類抗生素，更適合廣泛應(yīng)用于臨床。

阿維巴坦(Avibactam)是現(xiàn)今最具有發(fā)展前景的新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，機(jī)制可與β-內(nèi)酰胺酶絲氨酸形成共價(jià)化合物，且不發(fā)生水解導(dǎo)致其處于抑制狀態(tài)。除此之外，阿維巴坦在此過程中自身結(jié)構(gòu)由于逆反應(yīng)恢復(fù)可具有長效的抑酶作用。阿維巴坦在酶抑制類具有長效、抑酶譜廣，同時(shí)有藥代動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定、毒副作用微弱、耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，符合臨床對(duì)抗生素在耐藥菌方面的開發(fā)需要和制備合理的復(fù)方制劑。

3結(jié)論CRE的傳播流行對(duì)所有年齡段的患者都構(gòu)成了極大的威脅。碳青霉烯耐藥的分子機(jī)制是可變的，并且產(chǎn)碳青霉烯酶基因和其他抗生素耐藥機(jī)制的復(fù)雜多變等都加劇了CRE菌株的耐藥性。因此，了解CRE病原菌的耐藥分子機(jī)制、控制措施等對(duì)于提高公共衛(wèi)生安全防范意識(shí)，加深對(duì)其的理解與認(rèn)識(shí)十分重要。為減少CRE菌株引起多重耐藥感染給國家?guī)淼木揞~經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)CRE定居和/或感染等醫(yī)療相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行及時(shí)有效地干預(yù)，采取相關(guān)控制措施，如要強(qiáng)化醫(yī)療環(huán)境中的衛(wèi)生安全管理，提升醫(yī)護(hù)人員的手衛(wèi)生防范意識(shí)，加大實(shí)驗(yàn)室的投資建設(shè)、提高實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)水平，實(shí)施合理有效的抗菌方案以及積極研發(fā)新藥，對(duì)于防治多重耐藥菌株出現(xiàn)甚至阻止這些病原菌的傳播都有重要意義。