H型高血壓并發缺血性腦卒中患者MTHFR C677T基因多態性及血清Hcy水平的相關性研究*

李雅靜，張 瑞，吳 欣，王 鑫

(河北醫科大學第二醫院檢驗科，石家莊 050000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中(ischemic stroke，IS)的發病率高于出血性卒中，占腦卒中總數的80%，是目前引起世界范圍內死亡的第二大病因。高血壓是最常見的慢性病，是目前心血管疾病的主要死亡原因之一[1]。高血壓也是缺血性腦卒中的獨立危險因素，大約80%的腦卒中患者是因為高血壓而導致的[2]。《中國高血壓防治指南》(2010年修訂，第三版)將伴有血清同型半胱氨酸升高(Hcy>10μmol/L)的原發性高血壓定義為H型高血壓，H型高血壓會增加卒中的發生風險，且隨著Hcy水平的升高，卒中的風險也相應增加[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy在體內代謝過程中的關鍵酶，MTHFR基因C677T位點突變會導致MTHFR活性降低，導致Hcy代謝障礙，引發高同型半胱氨酸血癥。MTHFR C677T突變會增加缺血性腦卒中的發生風險，但研究者們的結論并不一致。近年來，對MTHFR基因多態性、血清Hcy水平與高血壓及腦卒中關系的研究受到研究者的關注[4-7]，但缺乏全面的研究來探討MTHFR基因多態性、血清Hcy水平與H型高血壓并發缺血性腦卒中的關系，且MTHFR基因多態性存在地域差異，血清Hcy基礎水平亦不同，因此，我們旨在探討本地區MTHFR C677T基因多態性、血清Hcy水平與H型高血壓并發缺血性腦卒中的相關性，對腦卒中的高危人群-伴有血清Hcy升高的高血壓患者做到早預防早干預，為降低卒中發生率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本項病例-對照研究共納入受試者491例，為2017年10月～2018年10月在河北醫科大學第二醫院就診患者，包括缺血性腦卒中組(185例)，H型高血壓并發缺血性腦卒中組(195例)及同期健康體檢者(111例)。缺血性腦卒中納入標準參照2014年中國急性缺血性腦卒中診治指南；H型高血壓納入標準參照2010年中國高血壓防治指南。H型高血壓并發缺血性腦卒中納入標準同時滿足H型高血壓和腦卒中的納入標準。納入的患者排除腫瘤、免疫系統疾病、甲狀腺功能疾病、肝腎功能不全等慢性疾病，以及一月以內的感染、創傷等急性疾病。

1.2 主要儀器和試劑 BR-526-24全自動雜交儀、BE-2.0生物芯片識讀儀購于上海百傲科技有限公司；PCR擴增儀購于杭州博日公司。羅氏Cobas 8000全自動生化分析儀購于羅氏公司。BioDrop超微量分光光度計購于英國柏點公司。BaiO核酸提取試劑盒、MTHFR(C677T)基因檢測試劑盒(PCR-芯片雜交法)、BaiO免疫顯色試劑盒購于上海百傲科技股份有限公司。同型半胱氨酸(Hcy)測定試劑盒(循環酶法)購于北京百奧泰康生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血清Hcy濃度測定：利用循環酶法檢測入組人群的血清中Hcy水平。采用羅氏Cobas 8000全自動生化分析儀及同型半胱氨酸(Hcy)測定試劑盒(北京百奧泰康生物技術有限公司)測定血清Hcy濃度。

1.3.2 MTHFR C677T基因型測定：采用MTHFR(C677T)基因檢測試劑盒(PCR-芯片雜交法)測定MTHFR基因型。①取200 μl EDTA抗凝全血按BaiO核酸提取試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)說明書嚴格操作提取基因組DNA，樣本提取后采用BioDrop超微量分光光度計測定其濃度和純度。②PCR擴增反應體系25 μl：2 μl DNA模板，22 μl MTHFR擴增液，1 μl反應液A。擴增反應條件：50℃預處理5 min；94℃預變性5 min；94℃變性25s，56℃退火25s，72℃延伸25s，共35個循環；再72℃延伸5 min。③取PCR擴增產物10 μl，加入190 μl雜交緩沖液中。按照BaiO免疫顯色試劑盒說明書操作，在BR-526-24全自動雜交儀中進行雜交反應。雜交反應結束后，在BE-2.0生物芯片識讀儀上讀取芯片，用BaiO基因芯片圖像分析軟件V2.0進行圖像掃描與數據分析，確定各樣本的MTHFR基因型。

2 結果

2.1 MTHFR C677T基因型和等位基因頻率在各組間的分布情況 見表1。采用PCR-芯片雜交法測定MTHFR基因型結果，將對照組、缺血性腦卒中組、H型高血壓并發缺血性腦卒中組進行兩兩比較。結果表明，缺血性腦卒中組和對照組的MTHFR基因型分布差異具有統計學意義(χ2=7.45，P=0.024)，缺血性腦卒中組CT，TT基型分布高于對照組，而CC基因型分布低于對照組，等位基因T頻率高于對照組而C低于對照組，差異均具有統計學意義(χ2=4.343，P=0.037)。H型高血壓并發缺血性腦卒中組和對照組的MTHFR基因型分布差異具有統計學意義(χ2=10.748，P=0.005)，H型高血壓并發缺血性腦卒中組TT基因型高于對照組，而CC，CT基因型低于對照組，等位基因T頻率高于對照組，而C頻率低于對照組，差異具有統計學意義(χ2=9.886，P=0.002)。H型高血壓并發缺血性腦卒中組和缺血性腦卒中組比較，MTHFR基因型分布，差異無統計學意義(χ2=2.668，P=0.263)，等位基因T頻率高于缺血性腦卒中組，但差異無統計學意義(χ2=1.399，P=0.237)。

表1 各組中MTHFR C677T基因型分布及等位基因頻率[n(%)]

2.2 對照組、缺血性腦卒中組、H型高血壓并發缺血性腦卒中組MTHFR基因型與Hcy水平的相關性分析 見表2。①對照組中TT型Hcy水平明顯高于CC型；而TT型與CT型、CT型與CC型之間差異無統計學意義(P=0.071，P=0.386)。缺血性腦卒中組中三種基因型之間Hcy水平差異有統計學意義，TT型Hcy水平明顯高于CT型和CC型(F=8.503～10.659，均P<0.05)，而CT型和CC型之間差異無統計學意義(P=0.892)。H型高血壓并發缺血性腦卒中組中三種基因型之間Hcy水平差異有統計學意義，TT型Hcy水平明顯高于CT型和CC型(均P<0.05)，而CT型和CC型之間差異無統計學意義(F=37.942，P=0.584)。②缺血性腦卒中組及H型高血壓并發缺血性腦卒中組的Hcy水平和對照組相比，差異具有統計學意義(均F=37.942，P<0.001)。H型高血壓并發缺血性腦卒中組的Hcy水平與缺血性腦卒中組Hcy水平相比，差異具有統計學意義(F=37.942，P<0.001)。

表2 各組中MTHFR基因型與HCY水平相關性分析

注1：a表示對照組和缺血性腦卒中組各基因型間血清Hcy水平結果的比較；b表示對照組和H型高血壓并發缺血性腦卒中組各基因型間血清Hcy水平結果的比較；c表示缺血性腦卒中組和H型高血壓合并缺血性腦卒中組各基因型間血清Hcy水平結果的比較。2：*表示各組內與TT基因型比較，P<0.05。

3討論本研究缺血性腦卒中組MTHFR TT基因型分布和等位基因T頻率均明顯高于正常對照組，說明MTHF TT基因型頻率的升高與缺血性腦卒中有明確的相關性。這與VIJAYAN等[8]的研究一致。但MTHFR C677T基因型與缺血性腦卒中的關系仍然存在爭議，最近一項中國東部漢族人群研究發現[9]，MTHFR C677T基因多態性和缺血性腦卒中沒有相關性。這些不同的研究所得到的結論不同可能是因為所選取的人群地域不同，基因多態性分布存在異質性或者其他因素的相互作用所導致。而H型高血壓并發缺血性腦卒中組和缺血性腦卒中組比較，MTHFR基因型分布差異無統計學意義，等位基因T頻率雖然高于對照組，但差異無統計學意義。說明H型高血壓對缺血性腦卒中患者MTHFR基因型分布的影響作用有限，提示H型高血壓與MTHFR基因多態性無明顯的相關性，但由于本研究納入的樣本量有限，尚需要擴大樣本量來進一步證實這一結論。在過去的二十年內，MTHFR C677T多態性與Hcy及原發性高血壓發生風險的相關性在不同的人群中進行了大量研究，但結論尚存在許多爭議[10-12]。FOWDAR等[13]采用病例-對照研究分析了澳大利亞高加索人群中Hcy代謝通路上的四個主要基因(MTHFR C677T，MTHFR A1298C，MTRR A66G，MTHFD1 G1958A)的多態性和原發性高血壓(EH)的關系，結果表明這四個基因的多態性和原血性高血壓無相關性。FAN等[14]對中國北方漢族人群的研究表明，T等位基因可能是原發性高血壓的危險因素。CAI等[15]在新疆漢族人群中的研究表明，MTHFR C677T基因多態性會影響血清Hcy水平，并且和原發性高血壓的發生密切相關，T等位基因可能是原發性高血壓的易感基因。錢凈等[16]對昆明地區漢族人群的研究表明，MTHFR基因C677T位點突變在H型高血壓的發生機制中可能具有重要作用，高于其它危險因素。

MTHFR在葉酸、Hcy代謝途徑中扮演了重要角色，MTHFR基因變異可導致5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)合成不足，由此影響Hcy向蛋氨酸的轉換，這是引起Hcy體內積聚的主要原因[17]。而Hcy可能的病理作用主要包括：損傷血管內皮細胞，促進血管平滑肌細胞增殖，促使載脂蛋白在血管壁堆積。本研究中缺血性腦卒中組和H型高血壓并發缺血性腦卒中組的TT基因型Hcy水平均明顯高于CT基因型和CC基因型，說明MTHFR基因C677T純合突變在高Hcy血癥的形成機制中具有重要作用。Hcy對于腦血管的危害明顯大于心血管，尤其與腦卒中第一大危險因素-高血壓具有高度協同性，同時存在H型高血壓可使腦卒中的風險增加，是導致我國腦卒中高發的最重要原因。本研究中H型高血壓并發缺血性腦卒中組Hcy水平明顯高于缺血性腦卒中組，提示對于H型高血壓患者更應依據高血壓防治指南的規定在降壓同時補充葉酸，降壓藥+葉酸(依那普利+葉酸)固定復方制劑，中國腦卒中一級預防研究(CSPPT)結果也證實，在相同血壓控制水平下，補充依那普利葉酸片可有效降低H型高血壓患者腦卒中發生率，以便及時進行臨床干預。

此外，本研究檢測了111例健康體檢者的MTHFR基因多態性，發現石家莊地區健康體檢者MTHFR 677CC，677CT，677TT基因型頻率分別為14.4%，49.5%和36.1%，T等位基因頻率為60.8%，與北京地區[18]漢族健康體檢人群結果(MTHFR 677CC，677CT，677TT基因型頻率分別為16.1%，47.5%和36.3%，T等位基因頻率為60.1%)相近。MTHFR C677T基因多態性的分布具有明顯的地域特異性，但不受年齡和性別的影響，這已在多個研究中得到證實[19-21]。YANG等[22]對中國10個地區進行了MTHFR C677T基因型分析，結果發現677TT基因型頻率和T等位基因頻率在南北方之間的差異很大，如山東的677TT基因型頻率和T等位基因頻率分別為40.8%和63.1%，而海南的677TT基因型頻率和T等位基因頻率分別為6.4%和24.0%。因此，通過MTHFR C677T分子流行病學調查，有助于了解本地區體檢人群的遺傳特征，以便為人群健康干預方案提供依據。

綜上所述，MTHFR C677T基因多態性與Hcy水平密切相關，并且MTHFR基因多態性和血清高Hcy水平均可能為缺血性腦卒中的危險因素。高血壓是卒中的首要可控危險因素，控制高血壓可遏制心腦血管疾病發病及死亡的增長態勢，而對于伴有血清Hcy升高的高血壓人群，更應注意在降壓同時補充葉酸，以降低H型高血壓患者腦卒中發生率。所以，TT基因型人群尤其是H型高血壓患者需要及時檢測該基因，爭取能夠做到早預防早干預。