風濕性心臟病伴房顫患者血漿sVCAM-1水平和eNOSmRNA表達與心內血栓形成的相關性研究*

張 萍，楊 靜

(陜西省商洛市中心醫院檢驗科，陜西商洛 726000)

風濕性心臟病(rheumatic heart disease，RHD)是一種由鏈球菌感染引起的自身免疫性疾病[1]。研究認為，RHD長期、反復的發作可能導致心瓣膜損傷，同時引起心房顫動，且伴發心房血栓、腦卒中事件等[2]，尤其是左心房內血栓脫落容易引起栓塞性疾病的發生[3]。研究認為內皮型一氧化氮合酶(eNOS)可能參與血栓形成的病理過程[4]。可溶性血管細胞黏附分子-1(sVCAM-1)的差異性表達可能增加血管內皮細胞的炎性反應進而促進血栓形成[5]。本文通過檢測RHD患者血漿sVCAM-1水平和eNOSmRNA的表達，探討其變化與心內血栓形成的關系，進而為RHD的治療提供依據。

1材料和方法

1.1 研究對象 收集2015年7月～2018年7月在陜西省商洛市中心醫院心內科住院治療的58例RHD患者的血液及臨床資料進行回顧性分析。其中包括二尖瓣病變者48例，二尖瓣、主動脈瓣聯合瓣膜病變者10例，均并發心房顫動。心功能分級( NYHA)為Ⅱ-Ⅲ級。所有患者依據心動超聲檢查結果是否有心內血栓分為血栓組和無血栓組。血栓組28例(血栓位于左心耳者22例、左心室者6例)，其中男性12例，女性16例，平均年齡50.6±11.7歲。無血栓組30例，男性12例，女性18例，平均年齡49.9±12.2歲。排除標準：冠心病、甲狀腺功能亢進、糖尿病、腫瘤、炎癥性疾病、肝腎功能不全及其他自身免疫性疾病患者。風濕性心臟病診斷依據中華醫學會風濕熱診斷和治療指南[6]。房顫的診斷均經心電圖和動態心電圖證實。圖1A顯示RHD二尖瓣膜狹窄，無血栓形成；圖1B顯示RHD有左室附壁血栓形成。對照組33例，均為同期體檢健康者，男性14例，女性19例，平均年齡49.3±12.7歲，無血栓病和家族史，2周內未服用任何藥物。各組研究對象的性別和年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究通過本院倫理委員會批準，并得到所有參與者的知情許可。

圖1A 風心病二尖瓣膜狹窄 圖1B 風心病左室附壁血栓形成

1.2 試劑和儀器 美國GE公司生產的Vivid Five型彩色超聲診斷儀。日本Sysmex CA-7000全自動凝血儀測定血漿D-D水平。德國西門子公司試劑盒進行酶聯免疫吸附試驗。RNA提取使用美國Invitrogen公司產品。PCR試劑盒采用上海久盛醫療用品有限公司產品。

1.3 方法 收集所有參與者的臨床資料(性別，年齡和血壓)。采用彩色超聲診斷儀分析RHD患者的左房內徑及心瓣膜病變。血漿總RNA提取采用Trizol法，eNOSmRNA的表達采用RT-PCR檢測。血漿sVCAM-1水平檢測采用酶聯免疫吸附試驗。

1.3.1 標本采集：所有參與者禁食12 h采集靜脈血，離心分離血漿，D-D和sVCAM-1水平于2 h內檢測，另取2 ml血漿保存于-80℃供測定eNOSmRNA備用。

1.3.2 eNOSmRNA表達檢測：血漿總RNA提取采用Trizol法，按照制造商的說明操作。mRNA的表達檢測采用TaqMan RNART-PCR。單鏈cDNA的合成采用TaqMan RNA特異性反轉錄引物，利用RNA特異引物和TaqMan MGB探針擴增。內參照采用β-actin。eNOSmRNA引物序列為，正義鏈：5’-GCCTCCCTGAGACCCTTTA-3’，反義鏈：5’-GTGTCGTGGAGTCGGCA-3’，擴增產物長度為330 bp。β-actin的引物序列為正義鏈：5’-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3’，反義鏈：5’-GCCTTCCATCCCTTTGCTTAG-3’；產物長度為670bp。PCR反應條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，50個循環后，于4℃結束反應。將擴增產物進行電泳。通過紫外分光儀掃描得出eNOSmRNA和β‐actin的吸光度，以β‐actin的吸光度為參考，求出eNOSmRNA吸光度的變化值(△Ct)，以2-△Ct得到eNOSmRNA的相對表達量。

2結果

2.1 各組LAD，血漿D-D水平和SBP比較 見表1。與對照組比較，血栓組和無血栓組的左房內徑(LAD)明顯增大，血栓組增大更顯著。與對照組比較，血栓組和無血栓組的D-D水平明顯高于對照組，其中血栓組增高更顯著，兩兩比較差異均有統計學意義(均P<0.01)。各組間收縮壓(SBP)的比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組LAD，D-D和SBP比較

注：與對照組比較，#P<0.01，■P<0.01，*P>0.05，●P>0.05；與無血栓組比較，▲P<0.01，★P>0.05。

2.2 各組血漿sVCAM-1 和eNOSmRNA結果比較 見表2。與對照組比較，血栓組和無血栓組sVCAM-1水平明顯上調，而eNOSmRNA表達則明顯下調。與無血栓組比較，血栓組sVCAM-1水平明顯上調，而eNOSmRNA表達則明顯下調。兩兩比較差異均有統計學意義(均P<0.01)。

表2 各組sVCAM-1和eNOSmRNA結果比較

注：與對照組比較，#P<0.01，■P<0.01；與無血栓組比較，▲P<0.01。

2.3 相關性分析 在血栓組和無血栓組中，sVCAM-1水平分別與D-D水平和LAD具有正相關性(r=0.839，0.799，P<0.01)，而eNOSmRNA表達與D-D水平和LAD則具有負相關性(r=-0.829，-0.782，P<0.01)。

2.4 ROC曲線分析 見圖2。以血栓組和無血栓組為因變量，sVCAM-1和eNOSmRNA的AUC分別為0.853(95%CI：0.747～0.960，P<0.01)，0.846(95%CI：0.736～0.957，P<0.01)。sVCAM-1和eNOSmRNA診斷血栓形成的敏感度和特異度分別為70.3%和81.5%，77.3%和85.7%。以上提示血漿sVCAM-1和eNOSmRNA對評價RHD血栓的形成有診斷意義。

圖2 sVCAM-1和eNOSmRNA的ROC曲線

3討論風濕性心臟病的發病在我國比較常見，其常常并發心房顫動，可能導致心內血栓的形成。尤其是心內栓子脫落能引起嚴重不良心腦血管事件，如急性心肌梗死和中風等[7]。既往的研究認為血管內皮細胞一氧化氮(NO)濃度下降會引起血管痙攣、血液中血小板黏附和聚集等，這些因素可能導致血栓形成風險的增加[8]。有報道認為心房顫動的病理過程可能導致血管內皮細胞損傷，進而降低NO濃度[9，10]。eNOS是內皮細胞合成NO的限速酶，其誘導心血管系統內源性NO的產生[11]。研究證實房顫患者eNOS活性的下調可能損傷內皮細胞分泌NO的能力[9]。eNOS的低表達會造成纖溶酶原激活物抑制劑-1的表達上調[12]，該產物造成纖溶系統失衡，容易誘發血栓性疾病，增加栓塞性疾病發生的風險[13]。有文獻報道eNOS表達水平的變化可能與RHD患者左心房血栓形成有關。其作用機制可能因為RHD的病理過程造成二尖瓣瓣膜口面積減小、左心房容量及左心房收縮期內徑增大等。這些病理變化提示患者處于機械性瓣膜梗阻狀態，進而引起左心房血流瘀滯、心室血流剪切力下降以及左心房內皮細胞損傷等，最終降低eNOS的表達及其生物活性，同時增加心內血栓形成的風險[14-15]。孫富強等[16]選擇39例行瓣膜置換術的風濕性心臟病患者進行研究，結果發現并發房顫的患者心房組織中eNOS表達顯著下調。本研究結果顯示RDH患者血漿eNOSmRNA的表達顯著下調，提示RDH患者過多的并發癥(房顫，二尖瓣病變等)可能是血栓形成的風險因素。eNOSmRNA在RHD兩病例組中的差異性表達提示血栓組患者心內血栓存在不穩定性，增加的血栓脫落風險容易導致栓塞性疾病的發生。因此，循環eNOSmRNA活性的檢測可預測RDH患者心內血栓的形成，評價栓子脫落的風險。

VCAM-1在白細胞運輸中發揮重要作用，其表達增加與許多慢性炎癥性疾病有關，并且可能誘發RDH患者左房血栓的形成與進展[17-18]。VCAM-1由內皮細胞分泌，脫膜后進入血液，可導致血漿sVCAM-1濃度顯著增高[19]。CHEN等[20]認為VCAM-1的過表達，可能與RHD心房顫動的發生和維持有關。GORTON等[21]研究認為持續的炎癥過程可增加RHD的發病率和該疾病的嚴重程度。進一步地研究發現RHD大鼠模型心臟瓣膜的單核細胞浸潤有助于打破免疫耐受，最終導致心臟瓣膜內皮細胞的損傷并增加內皮細胞中VCAM-1的表達。本研究結果顯示無血栓組血漿sVCAM-1水平顯著高于對照組，提示RDH的病理過程中伴隨有炎性反應的發生并且可能存在炎性血栓形成的風險。血栓組sVCAM-1水平的顯著增加，提示該標志物對RDH心內血栓的病變進展有一定的診斷價值，其差異性的表達顯示血栓可能存在脫落的風險。

應用彩色超聲診斷儀的研究顯示RHD患者心臟各腔室均有增大，尤其是心房[22]。預防RHD的并發癥心房顫動或改善心房顫動引起的心肌纖維化可能顯著緩解左心房內徑的擴大[7]。我們的研究顯示RHD患者血栓組患者LAD明顯增大，與上述報道相符。相關性的分析顯示sVCAM-1和eNOSmRNA分別與LAD有顯著相關性，推測兩標志物可能與風濕性心臟病的病理變化密切相關。D-二聚體在血漿中有較好的穩定性，其水平的差異變化可以反映體內的血栓形成以及纖溶活性亢進狀況。增高的D-二聚體水平被證實與體內的高凝狀態及血栓前狀態有關[23]。本研究顯示RDH患者血漿D-二聚體水平顯著增高，其中心內血栓形成患者增加更顯著，提示血栓組患者體內纖溶活性亢進，可能引起血栓脫落導致栓塞性疾病的發生。相關性分析也證實了sVCAM-1及eNOSmRNA與D-二聚體之間的相關性，推測兩標志物與RDH心內血栓的形成有關，可能參與了該病變過程的進展。ROC曲線的分析顯示，血漿sVCAM-1和eNOSmRNA對于診斷RDH心內血栓的形成呈現較高的靈敏度和特異度，尤其對栓子脫落的預測有診斷意義。

因此，RDH患者血漿sVCAM-1水平和eNOSmRNA表達的檢測可用于評價體內的凝血活性及纖溶活性，預測血栓形成的風險，并為RDH的治療提供依據。