渝東北地區胎兒染色體非整倍體疾病的NITP分析*

孟凡萍，郝 坡

(1.重慶三峽中心醫院檢驗科基因檢測中心，重慶 404000； 2.重慶三峽醫藥高等專科學校醫學技術學院，重慶 404020)

研究發現孕婦外周血中存在著胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，c-ffDNA)，主要源自胎盤滋養層細胞，無創產前基因檢測(noninvasive prenatal genetic testing，NIPT)是一種新興的無創產前檢測方法，該法就是基于檢測母體血漿，c-ffDNA，通過高通量測序技術對母體外周血中的c-ffDNA進行“非侵入性”產前檢測，較血清學檢查、超聲篩查以及現有創傷等產前診斷方法，更具簡便、快速、無創、可靠、易接受等特點，開辟了產前檢查的新篇章，對現有的產前篩查、產前診斷體系進行了很好的補充[1～3]，可根據NIPT的檢測結果對胎兒染色體非整倍體異常風險情況進行綜合評估[4]。孕婦血中的c-ffDNA的檢測與診斷中出現的染色體異常疾病有三種：21三體綜合征、18三體綜合征和13三體綜合征[5]。

本課題通過對渝東北地區2 784例12～24周孕婦采用高通量全基因測序，研究渝東北地區胎兒染色體21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征的發病率和年齡分布。

1材料與方法

1.1 研究對象 選取2016年7月～2018年5月在重慶三峽中心醫院基因檢測中心行NIPT檢測的2 784例12～24周孕婦外周血10 ml。

1.2 試劑和儀器 胎兒染色體非整倍體21三體、18三體、13三體檢測試劑盒(半導體測序法全套試劑(文庫構建試劑盒Ion Plus Fragment Library Kit，模板制備試劑盒Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit，測序試劑盒Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit，芯片Ion PITM Chip)由中山大學達安基因股份有限公司分裝提供，乳液PCR儀(ion one touch2)、ion one touch ES，DNA熒光定量儀(Qbit3.0 fluorometer)由美國LIFE公司提供，基因測序儀DA8600由達安基因股份有限公司提供，PCR擴增儀購自杭州安杰思生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胎兒游離DNA的提?。簩? 784例12～24周孕婦靜脈血10 ml分別于4℃ 3 000 r/min,15 min及13 000 r/min,10min兩次離心并分離血漿后，磁珠法提取游離DNA，存于-80℃。

1.3.2 文庫構建擴增：將DNA片段末端補平后，再與特異性接頭和P1接頭連接，PCR擴增DNA片段。PCR擴增條件：72℃20 min，98℃2 min，(98℃15 s，62℃15 s，70℃1 min)10個cycle，70℃5 min，4℃ hold。純化后將產物存于-80℃。

1.3.3 模板制備及上機測序：將文庫用Qbit3.0 fluorometer定量，每15份樣本為一批次，稀釋終濃度為100 pmol/L混樣后取適量與模板載體一同進行乳液PCR。在ion one touch ES上將乳液PCR產物富集，與測序質控模板、測序引物一同退火，加入到預處理后的測序芯片中上機測序。測序操作按照DA8600基因測序儀操作規程進行。

1.3.4 胎兒染色體信息分析：利用美國life公司二代測序平臺及生物信息分析技術，對2016年7月～2018年5月在重慶三峽中心醫院基因檢測中心行NIPT檢測的2 784例12～24周的孕婦進行分析，對NIPT結果顯示為高風險的孕婦實施羊膜腔穿刺及胎兒染色體核型分析，對NIPT結果顯示為低風險的孕婦進行電話隨訪至出生后。

1.4 統計學分析 采用卡方檢驗對數據進行統計分析。

2結果

2.1 孕婦患染色體非整倍體疾病高風險陽性率 見表1。行NIPT檢測的2 784例孕婦，高風險20例，其中21-三體高風險12例，18-三體高風險3例，13-三體高風險5例，陽性檢出率為0.72%(20/2 784)?！?0歲孕婦患染色體非整倍體疾病高風險的陽性率為2.97%，30～39歲為0.75%，<30歲為0.54%。

表1 渝東北地區孕婦NIPT高風險年齡分布

2.2 孕婦羊膜腔穿刺液細胞染色體核型分析 經檢測，染色體非整倍體疾病為高風險的孕婦有20例，其中有2例孕婦未做羊膜腔穿刺分析，而直接進行引產終止妊娠，其余18例孕婦行羊膜腔穿刺液細胞染色體核型分析，發現21-三體高風險有11例，18-三體高風險有2例，13-三體高風險有4例。把NIPT檢測后的結果與金標準方法--羊膜腔穿刺液細胞染色體核型分析技術檢測后的結果進行比較，發現21-三體和18-三體細胞染色體非整倍體異常高風險結果符合率為100%(11/11，2/2)，而13-三體細胞染色體非整倍體異常高風險結果符合率為80.00%(4/5)，其中1例為假陽性結果，假陽性率為20.00%(1/5) 。故NIPT診斷胎兒染色體非整倍體疾病的診斷敏感度為100.00%(2 784/2 784)，診斷特異度為94.44%(17/18)，假陽性率為0.03%(1/2 784)，假陰性率為0.00%(0/0)。

3討論1997年，香港中文大學盧煜明教授在懷有男性胎兒的孕婦外周血中擴增到了Y染色體的基因片段，因正常女性體內不含有Y染色體，從而說明孕婦外周血中存在胎兒游離DNA，經進一步檢測發現，c-ffDNA主要來源于胎盤滋養層細胞，從此開啟了孕婦產前檢測的新思路，這就是NIPT技術的發現過程[6]。NIPT技術主要有兩類：一類是采用高通量全基因測序，一類是采用靶向區域測序。NIPT技術主要適用于如下疾病的檢測，如唐氏綜合征(21-三體綜合征)、愛德華氏綜合征(18-三體綜合征)和帕陶氏綜合征(13-三體綜合征)。目前，這些染色體疾病尚無有效的治療方法，唯有通過早期的產前診斷來早發現，而傳統的血清學方法因假陽性率高、侵入性檢查有一定風險、孕婦難以接受等缺點不能很好開展相關檢測，而NIPT技術針對這三大染色體非整倍體疾病的檢測準確率高達99%以上，遠高于血清學篩查，且假陽性率和假陰性率更低[7-10]，故可作為當前產前檢測胎兒染色體異常的最佳手段。

NIPT技術是基于母體外周血中的c-ffDNA的檢測，其含量與孕周密切相關，據了解，c-ffDNA最早4周便可檢出，7周建立胎盤循環后c-ffDNA含量則以一定的比例穩步增加。NIPT的檢測精度與c-ffDNA含量的多少有關，當c-ffDNA含量低于4%時，NIPT可能檢不出或出現假陰性結果[11-12]，所以NIPT技術適用時間范圍為(12+0～26+6)周，最佳檢測時間范圍為(12+0～22+6)周，如果從技術層面上講，NIPT檢測孕周并無上限，26+6孕周限制的原因是考慮到如果NIPT檢測出現陽性結果，那么后續會留出合適的時間來進一步確診。

本研究顯示，渝東北地區胎兒染色體非整倍體疾病的陽性率為0.72%(20/2 784)，年齡分布為≥40歲孕婦為2.97%，30～39歲為0.75%，<30歲為0.54%。NIPT診斷胎兒染色體非整倍體疾病的敏感度為100.00%(2 784/2 784)，總特異度為94.44%(17/18)，總假陽性率為0.03%(1/2 784)，假陰性率為0.00%(0/0)。渝東北地區NIPT胎兒染色體非整倍體疾病的陽性檢出率為0.72%，以21-三體檢出為主，占61%，40歲高齡孕婦NIPT陽性率較其他年齡組明顯升高，達2.97%。

高通量基因組測序平臺及生物信息分析技術具有很高的敏感度和特異度，NIPT可提高產前診斷效率，其敏感度、準確度與羊膜腔穿刺分析技術具有高度的一致性，在快捷、安全、方便、患者易于接受的前提下，能減少患兒的出生，達到優生優育，具有較高的臨床和社會價值。