HPLC-MS/MS法檢測骨髓移植患者全血環孢素A(CsA)濃度及與AM1和AM4N代謝產物的相關性研究*

王 磊，孫文利，劉 瑞，王紅春，劉紅星，2

(1.河北燕達陸道培醫院，河北三河 065201；2.北京陸道培血液病研究院，北京 100176)

關鍵字：環孢素；高效液相色譜-串聯質譜法；血藥濃度；代謝產物

環孢素A(cyclosporine A，CsA)為多肽結構，主要作為免疫抑制劑使用，用于骨髓移植患者的抗排異和移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD的治療和預防[1-2]。由于CsA治療窗窄，毒性反應大，易導致移植失敗，進行CsA血藥濃度監測就顯得尤為重要。目前監測CsA血藥濃度的方法較多[3-10]，高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS法)[6-10]作為CsA血藥濃度監測的金標準，在歐美國家臨床實驗室被廣泛使用，較為著名的有Mayo clinic，Lab Test Directory，Quest Diagnostics和西雅圖移植中心。但由于其儀器昂貴，自動化程度低，需要專業的人員操作，故在國內臨床實驗室應用較少。CsA在患者體內有30多種代謝產物，代謝產物的量和活性各異，目前尚無相應的體內實驗證明其差異[1-10]。其體內代謝產物研究最多的有5種，分別為AM1，AM1c，AM4N，AM9和AM19，含量最多的為AM1，含量最少的為AM4N，兩者在患者個體內代謝情況目前尚無詳細數據可查，對其研究就顯得尤為必要。本文就CsA在骨髓移植患者體內代謝進行研究，采用HPLC-MS/MS法對移植患者各時間點全血樣本進行CsA和AM1及AM4N血藥濃度檢測，確定其相應關系，為研究CsA個體內代謝差異提供理論依據；同時對不同移植患者全血樣本進行CsA和AM1及AM4N血藥濃度檢測，確定其相應關系，為研究CsA個體間代謝差異提供理論依據。

1材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 CsA個體內代謝：選擇2018年6月21日前來我科做CsA藥物代謝研究的骨髓移植患者黃某，男，年齡15歲，診斷為急性淋巴細胞白血病(ALL)，患者每天早8點晚20點服藥，分別于服藥后0，1，2，3，4，6，8，10和12 h抽取靜脈血，共收集其18份全血樣本用于CsA血藥濃度測定，用HPLC-MS/MS方法對其全血樣本進行CsA及AM1和AM4N濃度檢測。

1.1.2 CsA個體間代謝：隨機選擇2018年6月21日前來我科做CsA藥物代謝研究的骨髓移植患者20例全血樣本，采用HPLC-MS/MS方法對其全血樣本進行CsA及AM1和AM4N濃度檢測。

1.2 試劑與儀器 試劑與儀器詳見本實驗室前期建立的同時測定骨髓移植患者全血CsA和AM1[17]；AM4N(HPLC Grade，Toronto Research)。

1.3 方法 本實驗室前期已建立同時測定骨髓移植患者全血中CsA和AM1的方法[8]，同時AM4N的質譜條件為AM4N：m/z 1 206.1～1 188.9，DP：70V，CE：19V；其它質譜條件和色譜條件與CsA和AM1相同。

1.4 統計學分析 利用SPP 16.0分別對個體內與個體間全血CsA，AM1和AM4N進行相關性分析，同時利用雷達圖進行各自比率分析。

2結果

2.1 色譜質譜行為 在以上色譜質譜條件下，測得AM4N二級碎片離子質譜圖，見圖1。CsA，AM1，AM4N，CsD質譜色譜圖，見圖2。AM4N的保留時間為3.57 min，以CsD為內標，AM4N峰面積與CsD峰面積比值(Y)對AM4N濃度(X)進行線性回歸，得AM4N回歸方程：Y=0.001 89X-0.009 65(r=0.993 7)，經方法學考察線性范圍、回收率、精密度、基質效應及穩定性均符合檢測要求，最低定量限為1.0 ng/ml，可用于定量分析。各峰型良好，無雜質峰干擾。

圖1 AM4N的二級掃描碎片離子圖 圖2 CsA，AM1，AM4N及CsD質譜色譜圖

2.2 HPLC-MS/MS法同時檢測個體內CsA，AM1和AM4N血藥濃度結果 該骨髓移植患者不同時間點的18例全血樣本CsA，AM1和AM4N血藥濃度檢測結果，見圖3。由圖3可知，該骨髓移植患者CsA代謝產物AM1在不同時間點含量均較大，而代謝產物AM4N在不同時間點含量均較小，這和以往研究結果一致[1-8]。對不同時間點的CsA，AM1和AM4N比率結果作雷達圖進行各自比率關系分析見圖4。可見，該患者一天內不同時間點AM1/CsA的比率大，同時波動也較大(0.28～1.34)，而AM4N/CsA和AM4N/AM1相應的比率關系較好，比率范圍分別為0.04～0.14和0.06～0.23。由圖4可知，也可進一步說明AM1在CsA代謝產物中占比較大，而AM4N在CsA代謝產物中占比較小。對三者進行相關性分析(見圖5)可知CsA和AM1的相關性較差(r=0.79)，與本實驗室前期研究結果一致[7-8]，而AM4N和CsA及AM1在該患者體內一定程度上存在相關性(r>0.9)。

圖3 HPLC-MS/MS法檢測CsA，AM1和AM4N血藥濃度結果 圖4 CsA，AM1和AM4N比率

圖5 相關性分析

2.3 隨機選擇的骨髓移植患者20例全血樣本CsA，AM1和AM4N血藥濃度檢測結果 見圖6。由圖6可知，隨機選擇的20例骨髓移植患者樣本CsA代謝產物AM1在不同個體檢測值波動較大(3～146)，而代謝產物AM4N在不同個體檢測值波動較小。對不同個體間的CsA，AM1和AM4N比率結果作雷達圖進行各自比率關系分析見圖7。可見，不同個體間AM1/CsA的比率波動也較大(0.05～1.20)，而AM4N/CsA和AM4N/AM1相應的比率關系較好，比率范圍分別為0.009～0.05和0.01～0.39。由圖7可知，也可進一步說明AM1在CsA代謝產物中占比較大，而AM4N在CsA代謝產物中占比較小。對三者進行相關性分析(見圖8)可知，個體間CsA和AM1的相關性較差(r=0.59)，AM4N和CsA及AM1在個體間不存在相關性(r<0.5)。

圖6 HPLC-MS/MS法檢測不同個體間CsA，AM1和AM4N血藥濃度結果 圖7 不同個體間CsA，AM1和AM4N比率

圖8 個體間結果相關性分析

3討論本文在王磊等[8]人的“HPLC-MS/MS法在骨髓移植患者全血CsA及AM1濃度測定中的應用”一文的基礎上，增加了CsA的代謝產物AM4N的檢測，明確了CsA在骨髓移植患者個體內不同時間點的代謝差異，進一步確定了AM1是CsA在骨髓移植患者體內代謝的最主要代謝產物，其占比高，含量大，且與CsA濃度的相關性較差。同時發現AM4N在CsA代謝產物中占比小，含量低，但其與CsA和AM1的相關性卻較好。同時，通過對個體間的CsA，AM1和AM4N血藥濃度檢測，也進一步證實了AM1是CsA的主要代謝產物，其含量大，但是與CsA的比例關系差別較大，同時有文獻報道AM1又具有生物活性[16-17]，這就解釋了為什么CsA在移植患者中有效濃度會有差異，AM4N在個體間的代謝比率有差異，但其總含量小，生物活性也低，對CsA有效血藥濃度范圍的影響較小。總之，不論CsA在個體內還是個體間代謝，其主要代謝產物AM1含量都較高，且差異較大，嚴重影響CsA有效血藥濃度范圍，而AM4N含量都較小，不影響CsA有效血藥濃度范圍。本文通過對骨髓移植患者個體內和個體間的CsA和AM1及AM4N血藥濃度的檢測，說明了CsA在骨髓移植患者體內代謝存在個體差異，同時也要求檢測CsA血藥濃度的檢測方法必須特異性強[9-10]，才能避免CsA代謝產物的干擾。