碧迪FACS CantoⅡ流式細胞儀性能評價及實驗室應用*

方佩琪，孫 林，顧梅秀，吳 蕙，潘柏申，郭 瑋，王蓓麗

(復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032)

流式細胞術(flow cytometry，FCM)是一種利用流式細胞儀對單細胞或生物顆粒進行多參數、快速分析的技術[2]。近年來隨著FCM不斷發展，逐漸從科研擴大到臨床，在腫瘤、感染、免疫和血液系統疾病的診治和監測中發揮了至關重要的作用[3]。尤其是分選技術的建立，為獲取目標細胞提供了強有力的技術平臺[4]。臨床對該技術在疾病檢測的應用范圍不斷擴大，例如淋巴細胞亞群分析、白血病/淋巴瘤/骨髓瘤免疫分型、CD34+干細胞絕對計數、人類白細胞抗原(HLA)-B27檢測、陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)檢測、血小板功能檢測以及人類白細胞表面CD64檢測等，都是目前臨床比較常規的項目，與疾病診斷、治療和預后監測密切相關[5-8]。因此流式細胞儀的性能評價是保障實驗室檢測結果準確的必要基礎[9]。此項研究以《YY/T0588-2017流式細胞儀》為依據，結合中華醫學會《流式細胞術臨床應用建議》[10]及多篇國內外參考文獻[11-13]，旨在建立本實驗室BD FACS CantoⅡ流式細胞儀的性能評價方法，為實驗室所開展的臨床及科研應用提供有效的保障。

1材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年1月30日復旦大學附屬中山醫院住院患者全血標本，共20份，標本使用BD乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝真空采血管采集，當天檢測。

1.2 試劑和儀器 BD FACS CantoⅡ流式細胞儀；BD FACS Calibur流式細胞儀；BD MultitestTM6-color TBNK Reagent試劑盒(BD六色淋巴細胞亞群試劑盒，CD3/CD4/CD8/CD19/CD16/56/CD45抗體)，貨號644611；BD MultitestTMIMK Kit試劑盒(BD四色淋巴細胞亞群試劑盒，包括A試劑：CD3/CD4/CD8/CD45抗體，B試劑：CD3/CD19/CD16/CD56/CD45抗體)，貨號340503；BD FACSTMLysing Solution(BD溶血劑)，貨號349202；BD TrucountTMTubes(BD 絕對計數管)，貨號340334；BD Calibrite APC Beads校準微球，貨號340487；BD FACS Diva CS&T Research Beads定標微球，貨號655050；BD DNA QC Particles標準微球，貨號349523；Beckman coulter IMMUNO-TROL Cells(貝克曼質控品)，貨號6607077；BD SpheroTMRainbow Calibration Particles(8peaks)3.0～3.4μm微球，貨號559123；SpheroTMNano Fluorescent Particle Size Standard Kit微球，貨號NFPPS-52-4K。

1.3 方法

1.3.1 儀器校準：

1.3.1.1 流式細胞儀的工作條件應符合：儀器說明書所規定的環境溫度、相對濕度、電源電壓、大氣壓力，并且防止陽光直射、避免熱源。在此基礎上實驗前應對儀器進行正確的操作和校準。

1.3.1.2 熒光檢出限和熒光線性：在1 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中加入1滴BD SpheroTMRainbow Calibration Particles(8peaks)3.0～3.4 μm微球，振蕩混勻后上機檢測，計算并得到相應的等量可溶性熒光分子數(molecules equiva-lent soluble fluorochrome，MESF)及MESF(Y)和平均熒光強度(X)的線性回歸方程、相關系數(r)。要求：流式細胞儀對FITC的熒光檢出限應不大于200 MESF，流式細胞儀對PE的熒光檢出限應不大于100 MESF，流式細胞儀對其他激光器所對應通道熒光素的熒光檢出限應符合制造商的要求；r≥0.98。

1.3.1.3 前向角散射光(FSC)檢出限：在1 ml去離子水中分別加入1.35，0.88，0.45和0.22 μm微球各1滴，振蕩混勻后上機檢測，得到直方圖上顯示的峰值信號和顯示峰值信號的標準微球直徑。要求：FSC檢出限≤1 μm。

1.3.1.4 儀器分辨率：取1滴BD CS&T 加入裝有500 μl PBS的試管中，混勻后上機檢測，獲得各通道的CV。要求：FSC，FITC和PE通道的CV≤3%。

1.3.1.5 FSC和側向角散射光(SSC)分辨率：①在1 ml PBS中，加入5 μl EDTA-K2抗凝外周血，混勻后上機檢測。要求：在FSC/SSC圖上可以區分外周血紅細胞和血小板。②在1 ml溶血劑中加入50 μl EDTA-K2抗凝外周血，混勻后上機檢測。要求：在FSC/SSC圖上可以區分外周血白細胞三群(淋巴細胞、單核細胞、粒細胞)。

1.3.1.6 倍體分析線性：用BD DNA QC Particles中小雞有核紅細胞(CEN)經過碘化丙啶(PI)染色后上機檢測，獲取G2/M期與G0/G1期平均熒光強度，計算兩者比值。要求：比值范圍1.95～2.05。

1.3.1.7 表面標志物檢測的準確度：使用BD六色淋巴細胞亞群試劑對貝克曼質控品進行CD3，CD4，CD8，CD16/CD56，CD19和CD45標記，依次記錄每次檢測的CD3，CD4，CD8，CD16/CD56和CD19陽性值的百分比，分別計算平均值。重復測定5次。要求：結果應在質控品說明書給定的靶值參考范圍內。

1.3.1.8 表面標志物檢測的重復性：使用BD六色淋巴細胞亞群試劑對貝克曼質控品進行CD3，CD4，CD8，CD16/CD56，CD19和CD45標記，分別計算CD3，CD4，CD8，CD16/CD56和CD19陽性百分比結果的CV。重復測定10次。要求：①陽性百分比≥30%時，CV值應不大于8%；②陽性百分比<30%時，CV值應不大于15%。

1.3.1.9 攜帶污染率：取BD Calibrite APC Beads三滴到BD絕對計數管中，加入PBS混勻后連續上機檢測3次，每次至少收集100 000個標準微球，計算標定區域的顆粒數，分別標記為Hi-1，Hi-2，Hi-3。再進行空白數量測試，連續測試3次，計算標定區域的顆粒數，分別標記為Li-1，Li-2，Li-3。按照此步驟重復循環3次，計算攜帶污染率(Ci)，取最大值。要求：攜帶污染率應不大于0.5%。

式中：Ci為第i次循環的攜帶污染率值；i=1～3。

1.3.1.10 儀器穩定性：取1滴BD CS&T 加入裝有500 μl PBS的試管中，混勻后上機檢測，測試完成后，利用直方圖分析實驗結果，計算開機0 h的標準微球的平均熒光強度(FL1)。連續開機8 h后，在相同參數設置條件下重復前步驟，計算得到標準微球的平均熒光強度(FL2)。按公式計算FL1，FL2的B值。要求：環境溫度變化不超過設定溫度的5%時，在開機8 h內檢測FSC及所有熒光通道峰值熒光道數的波動范圍應不超過10%。

式中：FL1為開機0 h的標準微球平均熒光強度。FL2為開機8 h后的標準微球平均熒光強度。

1.3.2 實驗室應用：儀器校準后，使用BD FACS Calibur流式細胞儀及其配套的BD四色淋巴細胞亞群試劑盒(包括A試劑：CD3，CD4，CD8，CD45抗體；B試劑：CD3，CD19，CD16/CD+56，CD45抗體)，對全血標本分別進行CD3，CD4，CD8，CD45和CD3，CD19，CD16/CD56，CD45標記，每份標本需標記兩管，共做20份，按標準操作規程上機檢測并分析結果。使用BD FACS CantoⅡ流式細胞儀及其配套的BD六色淋巴細胞亞群試劑盒(CD3，CD4，CD8，CD16/CD56，CD19，CD45抗體)，對全血標本進行CD3，CD4，CD8，CD16/CD56，CD19，CD45標記，每份標本只需標記一管，共做20份，按標準操作規程上機檢測并分析結果。分別記錄兩者的標本前處理、上機檢測和分析結果所用時間，并比較兩臺儀器的檢測結果，計算結果的平均數、標準差和兩者P值。

2結果

2.1 儀器校準

2.1.1 熒光檢出限和熒光線性：通過檢測計算得到FITC通道的熒光檢出限為40.18 MESF，PE通道的熒光檢出限為23.77 MESF；兩者的r都為0.999 9，均符合行業標準。

2.1.2 FSC檢出限：通過微球檢測，儀器可以很好區分四種大小的微球，最小可以檢測到0.22μm微球，符合行業標準。見圖1。

注：135表示1.35 μm微球；88表示0.88 μm微球；45表示0.45 μm微球；22表示0.22 μm微球。

圖1四種大小微球在FSC圖上檢測結果

2.1.3 儀器分辨率：FSC，FITC及PE熒光通道的CV值分別為2.3%，2.4%和2.4%，均符合行業標準。

2.1.4 FSC/SSC分辨率：通過FSC，SSC散點圖能夠將外周血中紅細胞和血小板明顯的區分開；且能區分淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞。均符合行業標準。見圖2。

注：Neu表示中性粒細胞；Mono表示單核細胞；Lymph表示淋巴細胞；RBC表示紅細胞；PLT表示血小板。

2.1.5 倍體分析：線性上機檢測后計算G0/G1期和G2/M期的平均熒光強度比值為1.98。結果符合行業標準。

2.1.6 表面標志物檢測的準確度：通過對Beckman coulter IMMUNO-TROL Cells質控品的檢測，得到并計算 CD3，CD4，CD8，CD16/CD56和CD19陽性值的平均值，所有平均值均在質控品說明書給定的靶值參考范圍內，見表1。

表1 表面標志物CD3，CD4，CD8，CD19，CD16/CD56陽性百分比(%)及參考范圍(%)

2.1.7 表面標志物檢測的重復性：通過對Beckman coulter IMMUNO-TROL Cells質控品分別連續檢測10次，得到每個表面標志的陽性結果并計算CV，分別為CD3：2.75%，CD4：1.86%，CD8：5.14%，CD16/CD56：7.33%，CD19：11.26%。結果均符合行業標準。

2.1.8 攜帶污染率：每管檢測后執行SIT FLUSH(儀器檢測標本時，每管間的管路自動清洗步驟)清洗，攜帶污染率分別為0.01%，0.03%和0.02%；不執行SIT FLUSH清洗，攜帶污染率分別為0.05%，0.04%和0.03%，結果均符合行業標準。

2.1.9 儀器穩定性：通過檢測開機0 h和8 h的FSC及各熒光通道平均熒光強度(FL1，FL2)，計算得到B值，結果均符合行業標準，見表2。

2.2 實驗室應用 使用BD FACS Calibur流式細胞儀及其配套的BD四色淋巴細胞亞群試劑盒，標本前處理時間為43 min，標本檢測時間為56 min，標本分析時間為12 min，共計111 min。使用BD FACS CantoⅡ流式細胞儀及其配套的BD六色淋巴細胞亞群試劑盒，標本前處理時間為31 min，標本檢測時間為25 min，標本分析時間為5 min，共計61 min。兩臺儀器分別檢測20份全血標本后所得的結果比較，差異均無統計學意義，見表3。

表2FSC和各熒光通道在0 h和8 h的平均熒光強度及偏差(%)

熒光通道FL1FL2B(%)FSCFITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7APCAPC-Cy7Pacific BlueAmCyan122 20415 35630 65139 63628 61460 90132 4529 78734 402122 69015 44030 17038 89028 14056 37230 1079 13832 266-0.40-0.551.571.881.667.447.236.636.21

注：FL1為開機0 h的標準微球平均熒光強度；FL2為開機8 h后的標準微球平均熒光強度。

表3 BD FACS Calibur與BD FACS CantoⅡ流式細胞儀檢測標本結果比較

3討論本次性能評價是依據國家食品藥品監督管理局最新發布的醫藥行業標準《YY/T0588-2017流式細胞儀》所進行，此新版標準是基于2005版《YY/T0588-2005流式細胞儀》所進行的調整，修改了熒光檢出限、熒光線性、前向角散射光檢出限、儀器分辨率和攜帶污染率的實驗方法；在原標準的基礎上新增了表面標志物CD19，CD16/CD56的準確度和重復性，從而進一步完善了對儀器的性能評價標準。

本實驗室首次將新版流式細胞儀的行業標準運用在BD FACS CantoⅡ流式細胞儀的性能評價中。通過本次實驗所得數據，對比參考文獻中邁瑞BriCyte E6流式細胞儀[14]和Beckman Coulter Navios流式細胞儀的性能評價結果，BD FACS CantoⅡ流式細胞儀在熒光檢出限、熒光線性和FSC靈敏度檢出限這三項性能指標中所得結果更為出色。三臺流式細胞儀在FSC，SSC分辨率和倍體分析線性方面均符合新版行業標準。BD FACS CantoⅡ流式細胞儀在表面標志物檢測準確度和重復性評價上均符合新版行業標準，且檢測結果的離散程度小于BD FACS Calibur流式細胞儀，而在儀器分辨率CV、攜帶污染率和儀器開機8 h穩定性這三項中，邁瑞BriCyte E6流式細胞儀和Beckman Coulter Navios流式細胞儀的性能指標較為出色。

在實驗室應用方面，BD FACS CantoⅡ流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群時所用的BD六色淋巴細胞亞群試劑盒，相比原先BD FACS Calibur流式細胞儀所用的BD四色淋巴細胞亞群試劑盒，大幅減少了標本前處理的步驟、縮短了上機檢測所需的時間，全面提升了標本分析過程。使用BD FACS CantoⅡ流式細胞儀利于本實驗室快速處理大批量標本，有效提高檢測效率，使工作人員在相同的時間內能處理并檢測分析更多的標本，從而為實驗室未來與臨床合作開展更多樣化的檢測項目提供了技術保證。

目前，隨著流式細胞術在臨床診療及實驗室科研等領域的廣泛應用，對儀器的性能評價方面提出了更為嚴格的要求，實驗室在日常工作中應更為全面地掌握各項評價指標的操作方法[15]。本次研究我們在新版標準的基礎上對實驗方案步驟深度細化，同時對各項指標的計算方法和結果進行了詳細說明。通過本次研究，證實了我科BD FACS CantoⅡ流式細胞儀各方面性能指標均符合新版行業標準技術要求，滿足臨床應用需求，可以為臨床各領域提供準確的數據輸出支持，并能依托新版行業標準與醫院內與其他臨床實驗室的各型流式細胞儀開展室間比對。隨著流式細胞技術在未來的不斷向前發展，其所涉及的技術標準和應用領域會進一步擴大，而穩定良好的儀器性能是必要的基礎，所以當我們在不斷重視實驗數據結果的同時，應更進一步將關注點投向儀器的性能與狀態，探索更完善的實驗室儀器評價方案。