雙氫青蒿素聯合吉非替尼抑制肺腺癌細胞周期和遷移能力的體外研究

宋芳華，羅 蒙，范 寧，周佳靜，李 巖

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，約占全部癌癥病例的11.6%，同時也是癌癥相關死亡的主要原因，約占全部癌癥死亡病例的18.4%[1]，其發病率高，5年生存率低于17%。肺癌包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，NSCLC包括腺癌(adenocarcinoma, AD)、鱗狀細胞癌(squamous-cell carcinoma, SCC)和大細胞癌(large cell carcinoma,LCC)等，約占肺癌的80%[2]，AD是肺癌最常見的病理類型。目前肺癌的治療手段包括手術、放療、化療、分子靶向治療、免疫治療及中醫中藥治療等，臨床上根據不同患者的個體情況，采取由多種治療方式組成的綜合治療。超過70%的NSCLC患者在確診時處于晚期[3]，原發腫瘤的快速生長和遠處轉移是導致患者預后不良的重要因素[4, 5]。由于各種治療手段療效有限，晚期NSCLC無法根治，此外，約30%的患者由于高齡及身體狀態評分較差等原因無法使用化療[6]。目前，亟需尋找新的藥物和聯合治療方案進一步提高晚期NSCLC的療效。

約25%的NSCLC患者存在表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變[7]，亞裔患者突變率高于西方患者，達51.4%[8]。文獻[9]已證實，與化療相比，EGFR酪氨酸激酶抑制藥(tyrosine kinase inhibitor, TKI)GEF，能顯著改善攜帶某些EGFR突變的NSCLC患者的無病生存時間(10.8個月vs5.4個月；HR：0.30；95%CI: 0.22～0.41；P<0.001)。但是原發耐藥和繼發耐藥限制了TKI類藥物的療效。

青蒿素是從黃花蒿莖葉中提取的一種有過氧基團的倍半萜內酯的復合物，是臨床一線的抗瘧疾藥物，DHA是青蒿素化合物的活性代謝物。研究發現，DHA對腫瘤具有一定的抑制作用[10, 11]。

本研究旨在利用DHA聯合GEF處理人肺腺癌A549和SPC-A-1細胞系，探究其對肺腺癌細胞增殖、細胞周期及遷移的影響，以期為下一步研究和臨床用藥提供基礎實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞A549和SPC-A-1購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection, ATCC)，細胞培養液DMEM購自美國Gibco，DME/F12購自美國Hyclone，胎牛血清購自依科賽，DHA和GEF購自美國Selleck，MTT購自索萊寶，細胞周期試劑盒購自天津三箭生物技術有限公司，兔抗人CDK4、Cyclin D1、MMP9、MMP2多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自美國Cell Signal Technology公司。

1.2 細胞培養及藥物處理 人肺癌細胞系A549用DME/F12培養液、SPC-A-1用DMEM培養液培養，培養液內均含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素，于37 ℃、含5% CO2恒溫孵箱培養。

DHA和GEF粉末分別用二甲基亞砜(DMSO)配成100 mM母液，-20 ℃避光保存，使用時分別用DME/F12或DMEM培養液稀釋到相應濃度。

1.3 MTT增殖實驗 取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，以3000個/孔均勻接種到96孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養過夜，用含0 μM、10 μM DHA、50 μM GEF、10 μM DHA+50 μM GEF的培養液，連續培養72 h，并分別于0、24、48、72 h每孔加入10 μl的MTT(濃度為5 mg/ml)，并設置不含細胞的空白NC孔，繼續培養4 h，移除上清液，加入100 μl二甲亞砜(DMSO)，室溫振蕩15 min溶解甲臢，用酶標儀在490 nm處測定OD值，細胞存活率(%)=(OD實驗組-OD空白NC)/(ODNC組-OD空白NC)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，以105個/孔均勻接種到6孔板中，37 ℃、5%CO2恒溫培養過夜，移去培養液，換用無血清培養液1 ml，37 ℃、5%CO2恒溫孵箱饑餓6 h，移去培養液，用含10 μM DHA和(或)50 μM GEF的培養液培養24 h，小心移去培養液，0.25%無EDTA胰酶消化，冷5%乙醇(PBS配)5 ml小心吹打形成單細胞懸液，4 ℃固定過夜。次日1500 r/min離心5 min，棄上清，冷PBS清洗2次，按試劑盒說明書加入PI染料，37 ℃孵育30 min，300目濾網過濾細胞，BD Accuri C6流式細胞儀檢測，Modfit軟件分析。

1.5 劃痕實驗檢測遷移 用記號筆于6孔板背后，每隔1 cm均勻劃線，橫穿過孔。每孔橫豎各3條線。取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，加入5×105個細胞，過夜培養，第2日用槍頭垂直于背后的橫線劃痕， PBS小心清洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入含10 μM DHA和(或)50 μM GEF的培養液連續培養，分別于0、24 h取樣，拍照。

1.6 蛋白印跡實驗檢測蛋白表達 對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，以2×105個/孔均勻接種到6孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養過夜，移去培養液，用含10 μM DHA和(或)50 μM GEF的培養液培養48 h，小心移去培養液，冷PBS清洗2次，用細胞刮刀于冰上將細胞刮下，收集于適當體積離心管，4 ℃，1000 g離心5 min，棄上清，沉淀加入含PMSF的RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，4 ℃，12000 g離心5 min，吸取上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度，加5×Loading Buffer煮沸，10% SDS-PAGE膠電泳后，將蛋白電轉到PVDF膜，5% BSA封閉1 h，BSA稀釋抗體到適當濃度，4 ℃孵育過夜，第二日TBST清洗10 min，3次，二抗37 ℃孵育1 h，TBST清洗10 min，3次，ECL顯影。

2 結 果

2.1 抑制肺腺癌細胞的增殖 如圖1所示，與NC組和單藥組相比，聯合應用DHA和GEF后，A549和SPC-A-1細胞的活力顯著降低，生長速度下降，且具有時間依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明聯合用藥能夠顯著抑制肺腺癌細胞的生長。

圖1 DHA聯合GEF對肺腺癌細胞增殖的影響

A.DHA聯合GEF抑制A549增殖的MTT結果；B. DHA聯合GEF抑制SPC-A-1增殖的MTT結果(①P<0.001)

2.2 DHA聯合GEF對肺腺癌細胞系周期的影響 用10 μM DHA和(或)50 μM GEF處理兩株肺腺癌細胞24 h后，流式細胞儀檢測結果如表1所示，與NC、DHA、GEF組相比，Com組中更多的細胞阻滯于G0/G1期。而WB結果顯示，與NC組和單藥組相比，Com組的細胞周期相關蛋白Cyclin D1和CDK 4表達下降更為顯著(圖2、表2)。

表1 DHA聯合GEF對肺腺癌細胞周期表達的影響

腺癌細胞NC組DHA組GEF組Com組A549 G0/G154.70±0.1862.03±2.3068.66±2.6077.00±2.50①②③ S24.10±1.9024.01±1.7019.96±2.808.72±0.70 G2/M21.21±2.1013.96±2.2011.38±0.8014.29±2.70SPC-A-1 G0/G150.82±1.1051.95±2.0063.40±1.6065.58±0.90①②③ S25.25±2.8026.96±1.6019.05±1.1018.86±0.80 G2/M23.93±2.2021.09±0.6017.55±1.7015.55±2.30

注：與NC組比較，①P<0.001；與DHA組比較，②P<0.001；與GEF組比較，③P<0.001

圖2 Western blot檢測DHA聯合GEF對肺腺癌細胞

分組A549Cyclin D1CDK 4SPC-A-1Cyclin D1CDK 4NC組1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 DHA組1.00±0.010.90±0.170.69±0.161.03±0.10GEF組1.12±0.020.72±0.120.32±0.060.66±0.12Com組0.80±0.13①③⑤0.40±0.16②④⑥0.11±0.15②④⑥0.51±0.16②④⑥

注：與NC組比較，①P<0.01，②P<0.001；與DHA組比較，③P<0.01，④P<0.001；與GEF組比較，⑤P<0.01，⑥P<0.001

2.3 DHA聯合GEF對肺腺癌細胞系遷移能力的影響 用10 μM DHA和(或)50 μM GEF處理兩株肺腺癌細胞，24 h鏡下觀察細胞，并利用Image Pro Plus軟件計算細胞融合率，如圖3A、B和表3，Com組細胞遷移率顯著低于NC組和單藥組。如圖3C和表4，WB結果顯示Com組MMP2和MMP9表達顯著低于NC組和單藥組。這些結果說明聯合應用DHA和GEF能夠抑制肺腺癌細胞遷移。

圖3 DHA聯合GEF對肺腺癌細胞A549遷移的影響

分組A549SPC-A-1NC組55.47±0.0456.36±0.08DHA組46.49±1.2638.09±1.22GEF組32.63±5.0524.47±1.03Com組20.81±2.87①②③8.32±0.83①②③

注：與NC組比較，①P<0.001；與DHA組比較，②P<0.001；與GEF組比較，③P<0.001

分組A549MMP2MMP9SPC-A-1MMP2MMP9NC組1.00±01.00±01.00±01.00±0 DHA組0.98±0.171.00±0.190.91±0.090.91±0.20GEF組0.64±0.190.81±0.200.99±0.210.86±0.19Com組0.58±0.19①③⑤0.51±0.10②④⑥0.77±0.19①③⑤0.61±0.17①③⑤

注：與NC組比較，①P<0.01，②P<0.001；與DHA組比較，③P<0.01，④P<0.001；與GEF組比較，⑤P<0.01，⑥P<0.001

3 討 論

肺癌因其高發病率和高病死率而成為嚴重威脅人類健康的腫瘤之一，其中肺腺癌的比例逐年升高。雖然手術、放化療、分子靶向治療、免疫治療，以及中醫中藥治療在肺癌中得到了廣泛的應用，但肺癌5年生存率低，晚期肺癌治療效果仍然有限。

GEF是美國食品藥品監督管理局于2003年批準上市的用于治療晚期NSCLC的一種分子靶向藥物，它是一類EGFR酪氨酸激酶的ATP競爭性抑制藥。GEF對乳腺癌細胞系[12]、膀胱癌細胞系[13]的有效性也得到了證實。GEF主要應用于攜帶EGFR19號外顯子缺失突變或21號外顯子L858R突變的NSCLC患者。部分NSCLC患者存在EGFR T790M突變、EGFR20號外顯子插入突變等耐藥突變，對GEF原發或繼發耐藥[14,15]，這限制了NSCLC的治療效果。因此，尋找一種新的治療策略來提高療效，改善患者的生活質量至關重要。青蒿素作為一種廣泛應用于瘧疾治療的藥物，最早由屠呦呦教授團隊在20世紀70年代合成，DHA是青蒿素的活性代謝產物。目前已有報道，青蒿素及DHA能夠起到抑制腫瘤生長的作用[10, 11, 16-18]。但其與GEF配伍治療肺癌的報道較少。

本研究在人肺腺癌細胞A549和SPC-A-1細胞中首先探究了DHA聯合GEF對于腫瘤增殖的作用，發現其能顯著抑制肺腺癌細胞的增殖，且具有時間依賴性。二者協同作用大于單藥對腫瘤的生長抑制作用。細胞周期紊亂是腫瘤細胞的一項重要特征，腫瘤細胞會不斷進入新的細胞周期，導致腫瘤惡性增殖。因此阻滯腫瘤細胞周期對抑制腫瘤生長尤為關鍵。本課題發現，使用DHA聯合GEF，使肺癌細胞系出現G0/G1期阻滯，鏡下細胞密度降低，生長減緩。WB顯示Cyclin D1和CDK4均顯著降低。Cyclin D1是一種細胞周期蛋白，普遍存在于真核細胞中，其表達與真核細胞的細胞周期同步升降；CDK4是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶家族成員之一。細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶與細胞周期蛋白協同作用，通過對絲氨酸/蘇氨酸蛋白的化學作用驅動細胞周期。Cyclin D1和CDK4表達降低預示細胞周期無法順利進行，即產生周期阻滯。WB結果進一步說明DHA聯合GEF協同抑制肺腺癌細胞的生長。

肺癌常通過淋巴和血液轉移。Gu等[19]發現，在NSCLC患者中，無淋巴微轉移的患者術后復發率為7%，而術前即存在淋巴微轉移的患者復發率增至45%。血行轉移常見部位為骨、腦、肝、肺、腎上腺等，因此抑制癌細胞的轉移是控制肺癌進展的重要策略。MMP家族在細胞遷移中起到關鍵作用，共有26個成員，其中研究較多的是MMP2和MMP9。MMP2和MMP9能降解細胞外基質，使得腫瘤細胞脫離原發灶[20]，隨血液或淋巴液轉移到新的部位生長。本研究發現聯合應用DHA和GEF有效抑制了肺腺癌細胞的遷移能力，并且該過程主要是通過抑制MMP2和MMP9實現的。

綜上所述，本研究發現，DHA和GEF能夠協同抑制肺腺癌細胞A549和SPC-A-1的增殖，阻滯細胞周期，并通過MMP2和MMP9抑制細胞遷移，下一步我們將繼續探究DHA聯合GEF對肺腺癌的抑制作用，以及逆轉上皮間質轉化的過程及潛在機制，為進一步揭示兩類藥物的抗腫瘤作用和未來的臨床應用提供理論依據。