老年人胃腸道間質瘤的c-kit和PDGFRa基因突變檢測

王曉紅，劉 然

胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是一類起源于胃腸道間葉組織的腫瘤，占消化道間葉腫瘤的大部分[1,2]。GIST占胃腸道惡性腫瘤的1%～3%，多見于老年人。GIST大部分發生于胃和小腸，其次是直腸和食管[2，3]。1998年， Hirota等[4]發現了GIST特征性表達KIT蛋白(CD117)并存在C-kit 基因的功能獲得性突變。2003年，Heinrich等[5]發現部分缺失c-kit基因突 變的GIST中存在血小板源性生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptorα，PDGFRα)的突變。突變的 KIT/PDGFRα可自動磷酸化，進而持續激活導致腫瘤發生[5-7]。目前，關于GIST致病的分子生物學機制在國外研究的比較深入。在我國，雖然發病率越來越多，但是相關的研究較少[8-10]。本研究旨在分析我國老年人GIST的分子病理學特征，為確立診斷和下一步的生物靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 收集我院病理科2005-01至2017-12存檔的老年GIST患者標本79例。入選患者均為第1次手術，均經過病理確診為GIST且資料完整。選擇同期老年胃腸道平滑肌瘤16例，平滑肌肉瘤7例，神經鞘瘤5例，共28例患者標本作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 標本免疫組化檢測CD117、CD34、S-100、SMA和Dog-1 所有組織標本均經10%中性甲醛固定6～30 h，石蠟包埋，4 μm連續切片。均由兩名高年資病理醫師根據WHO軟組織腫瘤分類(2013)的有關診斷標準進行診斷和分型[2]。在形態學診斷的基礎上，對每例標本均進行免疫組織化學染色，所用抗體分別為兔抗人CD117單克隆抗體、兔抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人S-100單克隆抗體、兔抗人SMA單克隆抗體和兔抗人Dog-1單克隆抗體。所用抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。所有抗體都采用SP二步法，DAB顯色。

1.2.2 c-kit基因及PDGFRa基因突變檢測 石蠟包埋組織的DNA提取，試劑盒由Gene公司提供。DNA純化后，按照參考文獻[9]的設計引物，PCR擴增c-kit基因第9,11,13,17號外顯子和PDGFRa基因第12,18號外顯子。提取石蠟切片組織DNA，并采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的基因。PCR產物純化后，用ABI3l0型測序儀(Applied Biosystems)測序，結果與基因庫(GeneBank)序列核對。

2 結 果

2.1 一般資料 79例老年GIST患者中，女37例(46.8%)，男42例(53.2%)。年齡60～92歲，其中65～75歲58例(73.4%)，為GIST高發年齡。腫瘤原發于胃36例，小腸24例，結直腸8例，食管6例，腸系膜5例。

2.2 組織分型及免疫分型 GIST組織學分析，梭型細胞型62例(78.5%),見圖1A; 上皮細胞型9例(11.4%)，混合細胞型8例(10.1%)。圖1B-D為免疫組化結果，染色顯示腫瘤細胞CD117+ (76/79, 96.2%)、CD34+(66/79, 83.5%)、DOG1+(72/79, 91.1%)。對照組不表達CD117和DOG1。

圖1 GIST的組織學和免疫表型

A.梭型細胞型GIST(HE，×200)；B.梭型細胞型GIST的彌漫性CD117陽性表達(SP，×200);C.梭型細胞型GIST的彌漫性CD34陽性表達(SP，×200);D.梭型細胞型GIST的彌漫性DOG1陽性表達(SP，×200)

2.3 c-kit基因突變情況 兩組均進行了基因檢測。79例老年GIST患者中有70例(88.6%)檢測到c-kit基因突變，69例為CD117陽性表達；其中， 11號外顯子突變66例(94.3%)，9號外顯子突變4例(5.7%)，未檢出17號外顯子突變。突變類型分析顯示：11號外顯子突變中，除了5例為純合性外，61例(92.4%)為其他雜合性突變；缺失突變6例；點突變4例；插入突變2例；點突變結合缺失突變的有1例。另外，1例78歲男性患者檢測到一個位于c-kit 641號的氨基酸由異亮氨酸突變為脯氨酸的突變位點。對照組未檢出c-kit基因突變。

2.4 PDGFRa基因突變情況 79例GIST中，70例發生c-kit基因突變，其余9例進行PDGFRa基因突變檢測， 有7例顯示為PDGFRa突變。7例中有2例無CD117表達，突變類型均為18號外顯子突變，6例為最為常見的點突變(D842V)；在另1例檢測到一種變異性突變，即氨基酸843-846處MHD的框內缺失,接著有一個S847T點突變。2例野生型GIST，僅為CD117、DOG1和CD34陽性，無平滑肌和神經標記物表達，未檢出PDGFRa基因突變。對照組亦未檢出該基因突變。

3 討 論

GIST以共同表達CD117、DOG1和CD34為特征，以c-kit和PDGFRa基因功能獲得性突變為其發生的重要分子機制[11-14]。對于組織學形態符合GIST，且CD117和DOG1陽性的病例可以直接診斷，適于進一步做基因檢測的病例包括以下情況：(1)部分擬進行靶向治療的患者；(2)CD117與DOG1表達不一致者；(3)鑒別c-kit/PDGFRa基因突變以外的野生型GIST；(4)鑒別同時性和異時性、多原發性GIST；(5)復發、轉移者或繼發性耐藥者。絕大多數GIST的診斷需結合免疫組織化學各標記檢測結果。CD117陽性部位在胞膜、胞質及核旁高爾基體區，但有5%～10%的病例CD117陰性[11]。對于組織學形態符合GIST，而免疫組化CD117或DOG-1陰性的腫瘤，均應進一步檢測這兩種基因的突變情況以協助診斷。文獻[11]報道，CD117、DOG1表達與胃腸間質瘤侵襲危險度有密切聯系，本組79例病例均具有CD117/DOG1表達和c-kit/PDGFRa基因突變，最常見的為11號外顯子突變，其次是9號外顯子突變，未檢出17號外顯子突變，這些改變是該腫瘤診斷的重要指標，也為其分子靶向治療提供了依據。

GIST中C-kit突變導致KIT結構改變，不需與其配體干細胞因子相互作用而自身形成二聚體，激活下游的信號轉導通路，引起細胞異常增殖與凋亡抑制，從而形成腫瘤。由于各研究組用于提取DNA的組織、實驗方法、病例構成等不同，因而其突變率臨床報道差異很大，為30%～92%[10, 14]。GIST 中c-kit基因突變最常見于外顯子11，突變方式可有點突變、片段的缺失和重復突變，第550～560位點即外顯子11 5′端以點突變和缺失突變為主，第570～580位點即3′端以重復突變為主[7]。本研究中GIST患者c-kit基因外顯子11突變最為常見，占82.3%，與文獻[13]報道一致。由此可見，該外顯子的單一檢測就可以解決大部分GIST的診斷問題。

PDGFRa與c-kit同屬于Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶家族,兩者結構極為相似[14]。在GIST中PDGFRα基因突變率雖然不高，但對于c-kit陰性GIST的檢出具有重要價值。越來越多有關GIST的基因突變檢測發現，有10%的腫瘤未檢出c-kit/PDGFRa基因突變，對于這些野生型GIST的甄別具有重要臨床意義，因為其對絡氨酸激酶抑制藥的靶向治療不敏感。此外，野生型GIST可能存有分子異常，如琥鉑酸脫氫酶缺陷、BRAF突變、14q缺失、TP53突變、P13K信號通路異常等分子改變[2, 6]。本研究發現的2例野生型GIST，對于臨床治療具有重要參考價值，因為這些病例對現有的靶向藥物可能不敏感。另外，我們所發現的位于c-kit 641號氨基酸由異亮氨酸突變為脯氨酸的突變位點和PDGFRa的變異性突變(S847T)，是否為新的突變類型？尚有待于進一步驗證。

目前，關于GIST的治療取得了顯著的進展。針對c-kit、PDGFRa基因突變酪氨酸激酶的抑制藥越來越多的用于臨床治療。臨床各期研究發現，GIST中c-kit和PDGFRa基因突變位點與格列衛分子靶向治療的療效有關。c-kit基因11外顯子突變的腫瘤對格列衛療效顯著，而9號外顯子突變者療效欠佳。大多數PDGFRa基因突變者(除外D842V)對格列衛治療敏感。無c-kit和PDGFRa基因突變者基本無效[15]。因此，GIST基因突變檢測對輔助診斷和指導臨床治療具有重要參考價值。