連艾煎的體外抗氧化活性研究

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1.廣東藥科大學藥學院/廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510006； 2.暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；3.廣州暨南生物醫藥研究開發基地有限公司，廣東 廣州 510632

連艾煎方出《松峰說疫》卷二，其配方為黃連與艾葉，具有調中下氣，清腸開噤之功效，主治瘟疫噤口下痢者[1]。黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC. Y. Cheng et Hsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖。以上三種分別習稱“味連”、“雅連”、“云連”。秋季采挖，除去須根和泥沙，干燥，撞去殘留須根。味苦，寒。歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經[2]。艾葉為菊科植物艾ArtemisiaargyiLevLet Vant.的干燥葉。夏季花未開時采摘，除去雜質，曬干。艾葉氣清香，味苦，艾葉味辛、苦，溫；有小毒。歸肝、脾、腎經[2]。黃連與艾葉皆為常用中藥，針對黃連或艾葉單方已有大量現代研究[3-9]。近年來，有關中藥復方的抗氧化研究備受廣泛關注，然而連艾煎作為一種傳統中藥復方，但在維普、CNKI或Pubmed等中內外各文獻庫皆沒檢索出對連艾煎有任何現代研究，也沒有對其抗氧化能力或藥理作用的研究，本實驗開展連艾煎的體外抗氧化活性研究，為連艾煎的進一步開發利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；紫外分光光度計(島津公司)；熒光顯微鏡(尼康公司)；電熱爐(廣州粵城電器廠)；循環真空泵(河南省予華儀器有限公司)；旋轉蒸發器(海道夫公司)，移液槍(艾本德公司)。

1.2 材料 黃連(產地：四川，批號：180801)、艾葉(產地：汕頭，批號：20180901)，均購于大參林廣州心誼路店，經廣東藥科大學王治平副研究員鑒定確定為毛茛科、黃連屬黃連CoptischinensisFranch.及菊科植物艾ArtemisiaargyiLevLet Vant.；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(規格1 g，純度96%，批號：W26F7E10072，源葉生物公司)；2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABT，批號E1506006，規格1 g，純度98%，美國Aladdin公司)；維生素C(規格100 g，純度99.7%，批號20130315，%國藥集團化學試劑有限公司)；過硫酸鉀(規格500 g，純度99.5%，批號P112191，美國Aladdin公司)；NAC(規格25 g，純度99%，批號A105420，美國Aladdin公司)；95%乙醇購自廣州化學試劑廠；ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

2方法

2.1 連艾煎的制備 連艾煎由黃連6 g，熟艾3 g組成。按處方取藥材，溫水浸泡30 min，加水100 mL，煎煮提取3次，每次60 min，過濾，合并濾液，濃縮至每1 mL藥液含生藥66 mg，即得。

2.2 溶液 配制61.8 μg/mL DPPH工作液：稱取6.18 mg DPPH粉末，用無水乙醇溶解并定容至100 mL。ABTS+自由基儲備液：稱取9.67 mg ABTS 和64.26mg過硫酸鉀于10 mL 的棕色瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，避光靜置過夜。

其中，A0為空白吸光度，A1為樣品自身對照吸光度，A2為樣品吸光度。

2.4 連艾煎對ABTS自由基的清除能力 根據文獻方法進行ABTS自由基清除能力測定[14-15]。ABTS在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS·+，在抗氧化物存在時ABTS·+的產生會被抑制，在734 nm或405 nm測定ABTS的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。實驗時，用80%乙醇將ABTS+儲備液稀釋成所需工作液，使其在室溫下于734 nm 處測得的吸光度在0.700 ± 0.020。取3.00 mL 新配制的濃度為ABTS+工作液置于10 mL具塞比色管中，使用移液槍分別加入6.06、12.12、18.18、24.24、30.30及36.36 μL的樣品溶液，蒸餾水補充至4.00 mL，混勻后室溫下避光反應30 min，在734 nm處測定其吸光度A2。另外再取3.00 mL 95%乙醇置于10 mL具塞比色管中，然后分別加入與樣品管加入量相同體積的樣品溶液，蒸餾水補充至4.00 mL，混勻后室溫下避光反應30 min，在734 nm 處測定其吸光度A1，重復實驗3次。清除率計算公式：

其中，A0為空白吸光度，A1為樣品自身對照吸光度，A2為樣品吸光度。

2.5 連艾煎對細胞內的活性氧簇(ROS)水平的影響 ROS水平檢測實驗根據參考文獻[16]，使用ROS檢測試劑盒進行。DCFH-DA探針法是一種利用熒光探針DCFH-DA進行ROS檢測的方法，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內，細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。取處于對數期的RAW264.7細胞(2×107個)接種于6孔板，分為空白組、ROS陽性對照組(Rosup，ROS檢測試劑盒提供，50 mg/L)、LPS組(100 μg/L)、LPS+ROS抑制劑(NAC，1.0 g/L)組、LPS+連艾煎組(1.5 g/L)、連艾煎自身對照組(1.5 g/L)。除ROS陽性對照組外，分別以相應藥物刺激細胞24 h，ROS陽性對照組刺激2 h。在超凈工作臺中避光下，DCFH-DA探針(ROS檢測試劑盒提供)用無血清培養基稀釋，使DCFH-DA終濃度為4.9 mg/L，每孔加入1 mL的DCFH-DA探針，在細胞培養箱中避光孵育細胞1 h，使用無血清培養基在超凈工作臺中避光清洗3次，以充分去除未結合的游離的DCFH-DA探針；在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞內的熒光強度的變化，激發波長488 nm，檢測波長525 nm，并對其進行拍照(200×)記錄(激發時間10 s，曝光時間1 s)。同時，使用ImageJ圖像處理軟件對ROS熒光強度進行灰度分析，隨機選取十個視野，獲取平均光密度，根據光密度對各組ROS進行相對定量。

3 結果

3.1 連艾煎清除DPPH自由基試驗 如表1所示，在一定的濃度范圍內，連艾煎對DPPH自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也逐步增加。連艾煎清除DPPH自由基的IC50為(2391.21±41.85)mg/L，陽性藥物維生素C清除DPPH自由基的IC50為(0.73±0.02)mg/L，兩者之間的差異非常顯著(P< 0.01)。

表1 連艾煎的DPPH自由基清除活性

3.2 連艾煎清除ABTS自由基試驗 在一定的濃度范圍內，連艾煎對ABTS自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，對ABTS自由基的清除率也逐步增加。連艾煎清除ABTS自由基的IC50為(240.96±4.66)mg/L，陽性藥物維生素C清除ABTS自由基的IC50為(1.14±0.04)mg/L，兩者之間的差異非常顯著(P<0.01)，結果見表2。

表2 連艾煎的ABTS自由基清除活性

3.3 連艾煎對RAW264.7細胞ROS水平的影響試驗 如圖1所示，空白組的細胞沒有檢測出ROS熒光，LPS組和ROS陽性組都檢測出明顯的ROS亮斑，而ROS抑制劑NAC則抑制了LPS引起的ROS升高。從圖1.e可以看出，連艾煎沒有抑制LPS誘導的RAW264.7細胞的ROS產生，反而增加了其生成，在LPS+連艾煎(1.5 g/L)的ROS熒光比之前4組都要高。從圖1.f可以看出，單用連艾煎刺激RAW264.7細胞也產生了類似的結果。使用ImageJ軟件對ROS熒光進行灰度分析(圖2)，可知Rosup組和LPS組的ROS熒光都比空白組高，且差異非常顯著(P< 0.01)，LPS+連艾煎組ROS熒光比LPS組高，且差異具有高度統計學意義(P< 0.01)，而連艾煎自身對照組ROS熒光則比空白組和LPS組都要高，且差異顯著(P< 0.05)，說明連艾煎自身可以引起細胞ROS升高。

4 討論

4.1 連艾煎方 出《松峰說疫》卷二，其處方包括黃連及艾葉，具有調中下氣，清腸開噤之功效，主治噤口痢，下痢赤白，腹中疼痛，里急后重，得食則吐者[1,17]。推測其解腸胃熱毒功能可能與其抗氧化能力有關，故對其抗氧化能力作初步測試[18]。連艾煎體外抗氧化實驗研究表明，連艾煎對DPPH及ABTS自由基具有一定的清除作用，雖然清除活性不如維生素C，但在一定范圍內其抗氧化作用與濃度也能呈現良好的量效關系。為了進一步探究連艾煎的抗氧化能力，我們使用了RAW264.7細胞模型檢測連艾煎對細胞ROS的影響。在細胞ROS實驗中，可以明顯看出ROS陽性對照(Rosup)、LPS都對細胞ROS熒光有顯著升高作用(P< 0.01)，同時，ROS抑制劑NAC顯著抑制了LPS引起的ROS升高(P< 0.01)，說明細胞ROS模型成功建立。LPS+連艾煎組顯示出比LPS組更強的熒光(P< 0.01)，說明連艾煎并不會抑制LPS引起的ROS升高，而相比空白組，連艾煎自身對照組顯著地增強了細胞ROS熒光(P< 0.01)，說明連艾煎自身會對細胞ROS產生有促進作用。與普通的抗氧化劑不同的是連艾煎在理化實驗中顯示出較強抗氧化活性，而在細胞實驗中則可以升高ROS水平，這個現象是值得深入研究的。

研究表明ROS與很多病理過程具有密切聯系，尤其是腫瘤[19-20]。Gorrini等發現胰島素升高細胞內ROS水平，后者進一步促進腫瘤細胞增殖[21]。Helfinger等研究顯示，高濃度的ROS可導致DNA損傷和突變，引起細胞惡性轉化[22]。有研究發現，ROS介導的PI3K/Akt信號轉導的過度激活利于腫瘤細胞存活以及促進化療耐藥[23-24]。因此，傳統觀點認為體內ROS升高可促進腫瘤形成、侵襲和轉移，并基于此尋找具有強抗氧化活性的天然產物作為開發抗腫瘤藥物的新方向[25]。

然而，ROS在癌癥中的作用仍存在爭議，最新的觀點認為機體低水平的ROS能夠增加癌癥風險，升高ROS反而利于癌癥治療。哥德堡大學的一項研究指出抗氧化劑NAC和維生素E分別使肺癌小鼠的最大存活率降低了60%和50%[26-29]。此外，Lee等發現放射治療使機體產生ROS能引起DNA損傷，從而破壞癌細胞[30]。Zhen和Hu等研究顯示，在膠質母細胞瘤中，ROS水平升高會導致乳腺癌細胞對電離輻射的抗性降低，從而增強癌細胞對放射治療的敏感性[31-32]。普通抗氧化劑有效地減少ROS的生成，從而使癌細胞的生長不受干擾，詹姆斯沃森(James Dewey Watson)甚至認為，抗氧化劑不但無助于預防癌癥，還可能引發癌癥[33-34]。

綜上所述，關于ROS在癌癥中的作用的研究日益增多，但學術界對ROS是致癌還是抗癌目前尚未有統一的觀點，ROS作為腫瘤促進劑或抑制劑的作用都有大量證據支持，這種悖論被解釋為適應性穩態，細胞內存在一種平衡，可能引起細胞損傷的活性物質也能激活保護細胞的生物途徑，這種平衡取決于活性物質的濃度[35-36]。

氧化應激促進癌癥發展和殺傷癌細胞的作用為兩種相反的癌癥治療策略提供了不同的理論基礎。一種方法是使用抗氧化劑提高ROS清除能力，從而消除ROS信號并抑制腫瘤生長，另一種相反的方法是用具有促氧化劑殺傷癌細胞，促氧化劑可增加ROS生成或消除癌細胞抗氧化系統[37]。連艾煎的抗氧化活性實驗顯示出連艾煎具有較強的抗氧化活性，同時可以升高細胞ROS水平。通過對連艾煎抗氧化活性的研究，在一定程度上預示連艾煎可能因為升高ROS帶來健康風險，也可能成為一種避免細胞ROS減少而導致癌癥風險增加，甚至可以通過引起ROS升高而增加癌細胞對放射治療敏感度的抗氧化劑。連艾煎對腫瘤到底起到何種作用值得進一步研究。