山莓葉揮發油提取優化及GC特征圖譜比較

1.湖南省懷化市產商品質量監督檢驗所，湖南 懷化 418000； 2.中南林業科技大學材料科學與工程學院，湖南 長沙 410000

山莓(RubusCorchorifoliusL.f)是薔薇科懸鉤子屬落葉灌木，山莓根、莖、葉、果實均可入藥[1]。根性味微苦、辛、平，具有活血化瘀、祛風除濕、解毒斂瘡的功效，主治痢疾、遺精、濕疹、毒蛇咬傷、閉經痛經、風濕腰痛、小兒疳積等癥[2]，果實性味微甘、酸、濕，可生食、制果醬及釀酒，未成熟果實常用于替代覆盆子入藥做引，具有化痰止渴、澀精益腎、助陽明目之功效，主治腎虛、遺精、醉酒、丹毒等癥[3-4]。葉性微苦，具有解毒、消腫、斂瘡、清熱利咽等作用，主治咽喉腫痛、多發性膿腫、乳腺炎等癥[5]。目前山莓葉及其揮發油的化學成分和生物活性研究雖已見報道[6-8]，由于生態環境的多樣性，意味著二次代謝產物的多樣性，為了更好地利用山莓資源，研究采用水蒸餾提取、同時蒸餾萃取、微波輔助萃取等方法提取山莓葉揮發油，并對微波輔助萃取條件進行優化，對GC測定不同采收期山莓葉揮發油，試圖尋找山莓葉揮發油的特征峰，為開發和評價山莓葉提供依據。

1 實驗部分

1.1 材料 山莓葉采自湖南張家界市永定區三角坪，經吉首大學城鄉資源與規劃學院廖博儒研究院鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物山莓(R.corchorifoius L)的葉，每月中旬采集，陰干，粉碎，低溫保存。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器 蒸餾萃取裝置，RE-5298旋轉蒸發器，UV-2600紫外分光光度計，萬分之一天平，安捷倫GC7890氣相色譜儀，CW-2000超聲微波協同萃取裝置，電爐，真空干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 提取方法的選擇 水蒸氣蒸餾：取山莓葉粉100.00 g于1000 mL燒瓶中，加入去離子水800 mL，冷凝回流5 h，收集蒸出液，用NaCl飽和，乙醚萃取，無水Na2SO4脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，即得淺黃色山莓葉揮發油。

蒸餾萃取：取山莓葉粉100.00 g于1000 mL燒瓶中，加入去離子水800 mL，取200 mL乙醚于燒瓶中，同時蒸餾萃取5 h，收集乙醚萃取液，用無水硫酸鈉脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，即得黃色山莓葉揮發油。

微波輔助提取：取山莓葉粉100.00 g于1000 mL蒸餾燒瓶(微波專用)，加入去離子水800 mL，裝上水蒸氣蒸餾裝置，微波功率100 w，冷凝回流3 h，收集蒸出液, 乙醚萃取，無水Na2SO4脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，得到黃色山莓葉揮發油。

1.3.2 單因素實驗 取山莓葉粉100.00 g于1000 mL燒瓶(微波專用)，去離子水800 mL，裝上蒸氣蒸餾裝置，分別依次考察固液比1∶ 6、1∶ 8、1∶ 10、1∶ 12，微波功率60、80、100、120 w，微波時間0.5、1、2、3 h。收集蒸出液，乙醚萃取，無水Na2SO4脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，即得山莓葉揮發油。以得率為指標，考察上述因素的影響。

1.3.3 正交試驗 利用L9(34)設計，考察固液比、微波功率、微波時間對得率的影響，優化提取條件，因素水平見表1。

表1 揮發油提取影響因素及水平

1.3.4 GC色譜條件 石英毛細管柱BP×5(25 m×0.22 mm×0.25 μm)；高純氮氣，進樣量0.5 μL。程序升溫：初始溫度： 40℃，保持3 min，以5.0℃/min速率升至200℃，保持10 min，不分流進樣，進樣器230℃，檢測器250℃。

2 結果與分析

2.1 提取方法的選擇 由表2可以看出，微波提取得率0.278%，比同時水蒸氣蒸餾和蒸餾萃取得率高。

表2 不同方法提取得率

2.2 單因素的影響 從圖1可知，隨著微波提取時間的增長，山莓揮發油得率增加。2 h 以后，提取時間增長，得率增長平緩，考慮到能耗，選擇微波時間2 h為宜。從圖2可見，液料比1∶ 6時，山莓葉揮發油得率低。隨著液料比的增大，得率平緩增大，本實驗可以選擇料液比1∶ 8。從圖3可看出，隨著微波功率逐漸增大，山莓液揮發油得率增加。這是由于微波功率越大，使分子熱運動動能增大，得率相應增加，但微波功率增加，極易造成爆沸現象，本實驗將微波功率控制在120 w以下。

2.3 正交試驗 由表3可知，影響山莓葉揮發油提取的因素順序為：微波時間﹥微波功率﹥固液比，最佳提取條件為A2B3C3，這與上述實驗不一致，為此，以A2B3C3進行驗證實驗，得率為0.2705%，與極差分析一致。表4方差分析可知，微波時間、微波功率、固液比對提取影響顯著。其中，微波時間對得率影響最顯著，微波功率次之。結果表明微波輔助最優條件為料液比1∶ 10、微波功率120 w、微波時間2 h。

表3 山莓葉揮發油提取正交實驗數據L9(34)

表4 揮發油提取方差分析

2.4 不同采收期山莓葉微波輔助蒸餾提取 按2.3正交實驗優化微波輔助條件，取100.00 g不同采收期山莓葉粉于1000 mL燒瓶(微波專用)，去離子水800 mL，裝上水蒸氣蒸餾裝置，微波功率120 w，冷凝回流2 h，收集蒸餾液，乙醚萃取，無水Na2SO4脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，即分別得到不同采收期山莓葉揮發油。由表5可知，不同采收期的山莓葉，其揮發油得率隨采收時間變化，其中6～7月揮發油得率在0.45%以上，3～4月揮發油得率低于0.26%

表5 微波輔助提取不同采收期山莓揮發油得率

2.5 不同采收期山莓葉揮發油GC特征圖譜 按1.3.4項下GC色譜條件，檢測從3月到10月不同采收期山莓葉的揮發油，記錄25 min色譜圖，見圖4。不同采收期山莓葉揮發油GC圖譜進行比較，確定八個共有峰，均在22 min內出現, 各個共有峰的相對保留時間一致，各個共有峰的相對峰面積變化趨勢基本一致，共有峰百分比均大于81%。不同采收期山莓葉揮發油化學成分種類和數量有明顯相似度，這與采集地、提取方法相同有關，提示了同一生長地域共有峰相對穩定。結果見表6-8。

表6 山莓葉揮發油GC特征圖譜共有峰保留時間 (t)

表7 山莓葉揮發油GC特征圖譜共有峰相對峰面積

表8 揮發油GC特征圖譜共有峰及非共有峰的百分比

3 討論

山莓葉揮發油具有消炎殺菌作用[8]，本研究主要考察揮發油得率，其中微波輔助提取得率為0.278%。優化提取條件：微波功率120w、料液比1：10、微波時間2h，山莓葉揮發油得率隨著采收期不同變化，氣溫高時揮發油得率高， 6月、7月揮發油得率達到0.45%。

植物揮發油的化學成分復雜，同時受到氣候環境、地理環境、不同采收期等等多種因素的影響，本實驗說明同一生長地山莓葉揮發油的化學成分相對穩定穩定。該法操作簡便，根據GC出峰的次序及出峰特征，獲得不同采收期山莓葉揮發油的特征圖譜，以期為綜合評價山莓葉揮發油提供依據。