miR-182在老年慢性心力衰竭病人循環中的表達及意義

多種微小RNA(microRNA,miR)在心臟中特異性表達或高表達,且調控著心肌細胞的分化、肥大、增殖和凋亡等功能,其中miR-1、miR-133、miR-208、miR-499等認為是心肌發育調控的重要參與者[1-3]。心力衰竭(心衰)是一系列心血管疾病的最終結果,在心衰進展過程中的典型表現是心肌重構和心肌間質纖維化。miR-133、miR-21、miR-210、miR-499等多種miRNA在心衰時表達水平明顯增加,表明這些miRNAs參與了心臟病理性肥大及心衰的發生,從而可以成為有效的心衰生物標記物[4-8]。本研究旨在觀察miR-182在老年慢性心衰病人循環中的表達,以及不同心功能分級中miR-182表達水平的變化,探討miR-182在老年慢性心衰診斷及預后中的判斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年10月至2017年4月在我院住院符合Framinghan診斷標準的慢性心衰的老年病人94例(心衰組),參照美國紐約心臟病學會(NYHA)分級,其中NYHAⅡ級32例,NYHAⅢ級32例,NYHA Ⅳ級30例。排除急性感染、自身免疫性疾病、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤病人。并選取同期健康體檢老年人31例為對照組。本研究所有入選病人均簽署知情同意書,并經我院倫理委員會批準(ZPYYLL-2015-23)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料:專人測量身高、體質量。全自動生化儀測定血常規、肝腎功能、C反應蛋白(CRP)。

1.2.2 N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)檢測:空腹抽取靜脈血2 mL,肝素抗凝,采用電化學發光法自動免疫儀檢測血漿NT-proBNP。

1.2.3 miR-182分析:采用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術檢測miR-182表達情況。以RNeasy Plus RNA試劑盒(QIAGEN公司)提取血漿總RNA,測定RNA濃度,對符合A260/A280 比值為1.8～2.0的總RNA才進行下一步qRT-PCR反應。以SuperScript Ⅲ試劑盒(Invitrogen公司)合成cDNA,以QuantiTect SYBR Green 試劑盒(QIAGEN公司)進行qRT-PCR:cDNA稀釋10倍。miR-182的莖環引物序列:正向5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG CACTGGATACGACAGTGTG-3′,反向5′-TTTGGCAATGGTAGAACTCA-3′。以U6為內參,莖環引物序列:正向5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATT GCACTGGA TACGACAAAATATG-3′,反向5′-TTAGCATGGCCCCTGC-3′。采用386孔板20μL體系(2x SYB Green 10μL,稀釋后的cDNA 7μL,10μmol/L混合后的引物3μL)。50°C 2 min 1個循環;95°C 10 min,1個循環;95 °C 15 s、 60 °C 30 s、 72 °C 30 s,40個循環;72°C 10 min,1個循環。于ABI 7900熒光 PCR儀進行。采用2-ΔΔCt法進行相對定量。

1.2.4 超聲心動圖檢查:采用美國HP5500型彩色多普勒超聲心動圖儀,探頭頻率2.5 MHz,測定左室射血分數(LVEF)。

2 結果

2.1 2組一般臨床資料比較 對照組與心衰組比較,年齡、性別、體質量指數(BMI)及白蛋白、血紅蛋白(Hb)水平差異無統計學意義(P>0.05),而尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 血漿miR-182、NT-proBNP、CRP水平及LVEF比較 經方差齊性檢驗,miR-182、NT-proBNP、CRP、LVEF均不齊,予非參數檢驗。結果顯示,心衰組血漿miR-182、NT-proBNP、CRP水平與對照組比較明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01)。心衰組LVEF與對照組比較明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 2組一般臨床資料比較

注:與對照組比較,*P<0.05

表2 2組循環miR-182、NT-proBNP、CRP水平及LVEF比較

注:與對照組比較,**P<0.01

2.3 相關性分析 Spearman相關分析顯示,miR-182與性別、BMI、CRP無相關關系(P>0.05),與年齡、BUN、Cr、NT-proBNP、心功能分級呈正相關(P<0.05),與白蛋白、Hb、LVEF呈負相關(P<0.05)。NT-proBNP與年齡、BUN、Cr、CRP、心功能分級呈正相關(P<0.05),與BMI、白蛋白、Hb、LVEF呈負相關(P<0.05)。見表3。

表3 心衰組miR-182、NT-proBNP與各指標的相關分析

2.4 ROC曲線分析 miR-182診斷心衰的AUC為0.751,95%CI為0.658～0.843,敏感度為40.4%,特異度為93.5%。NT-proBNP診斷心衰的AUC為0.896,95%CI為0.843～0.949,最佳臨界值為618 ng/L,此點其敏感度為75.5%,特異度為100%。兩者AUC比較,差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

老年慢性心衰病人癥狀和體征多為非特異性,且行動不便不易配合外出檢查,早期確診有一定困難[9]。目前,臨床多通過檢測BNP/NT-proBNP來協助早期診斷慢性心衰。但BNP或NT-proBNP不僅在一些非心血管疾病中會升高,也受年齡、BMI、腎功能等影響。因此,我們一直在尋找相對更理想的生物學標記物早期診斷老年慢性心衰。

miR-182屬于miR-183/96/182簇的一員,定位于人7號染色體,在多種細胞和組織中表達,如成骨細胞、淋巴細胞、視網膜、內耳以及脂肪組織等[10-12]。miR-182可通過調節不同的靶mRNA對生物體的生長、發育、分化發揮重要調控作用,尤其是在腫瘤的形成和發展中發揮重要作用[13-14]。近年來研究發現,miR-182在糖、脂代謝的調控方面發揮著重要作用,其表達的紊亂可能會導致肥胖和糖尿病等代謝相關疾病以及動脈粥樣硬化的發生[15-16]。我國學者發現,miR-182通過抑制靶基因Racl可以抑制高糖誘導的心肌細胞肥大[17]。心肌細胞肥大是心功能降低的主要結構改變,由此可推測miR-182可能參與心衰的發生。之后的研究證實了這個推論。Cakmak等[18]通過微陣列分析不同NYHA分級(Ⅱ～Ⅳ)病人及健康對照人群的miRNA,結果顯示miR-182在心衰病人中明顯升高,進一步分析ROC曲線的AUC,發現miR-182判斷心衰的預后方面優于NT-proBNP及hs-CRP。我們的研究顯示,miR-182在心衰病人中的表達明顯高于健康對照人群,進一步行相關性分析,發現miR-182與NT-proBNP呈正相關(r=0.352,P<0.01)、與LVEF呈負相關(r=-0.246,P<0.01),而且隨著心功能的下降逐漸升高(r=0.461,P<0.01),提示miR-182在心衰的診斷及預后判斷方面具有一定的價值。但是我們發現,無論是與LVEF及心功能相關性的程度,還是在診斷心衰的敏感性、特異性,miR-182均不占優勢,這與Cakmak等[18]的研究結果并不一致。還需要更大樣本的研究進一步驗證。

總之,血漿miR-182表達水平對老年慢性心衰病人的診斷及預后評價具有一定的臨床意義。與NT-proBNP相比較,miR-182同樣受年齡、腎功能、Hb、白蛋白影響,且特異性、敏感性不如NT-proBNP。但我們也認識到,本研究受樣本數量較少、年齡跨度較大、未跟蹤隨訪等因素影響,可能導致本研究結論不全面,故今后尚需擴大研究樣本量,并進行跟蹤隨訪深入研究進一步證實。