響應面法提高植物乳酸菌和嗜酸乳桿菌發酵椰奶的活菌數

謝雨婷，宋明慧，馬毛毛，陳蘢，楊俊，文學方,3，曽哲靈,3，余平,3*

1(南昌大學 食品學院，江西 南昌，330031) 2(南昌大學 資源環境與化工學院，江西 南昌，330031) 3(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330047)

椰子是熱帶主要果品之一，椰奶中富含中碳鏈甘油三酯[1-3]、低聚糖[4]、植物蛋白[5]、鋅、鈣、鐵等對人體有益的微量元素[6]和多種必需氨基酸[7]，且不含乳糖,具有快速提供能量，益氣生津，祛暑解渴[8]的功能。目前市場上的椰子飲品主要是椰子原汁飲料和風味酸奶，因其特有的濃郁椰香、圓潤口感而廣受消費者喜愛，而針對椰奶的益生菌風味飲品的開發研究較少[9-10]。椰汁富含利于乳酸菌生長的天然營養物質，可提供優良的發酵環境[8, 11-13]。植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌可共生定殖于人體腸道而改善機體健康[10-17]。相比較于傳統單一的椰子榨汁飲料及市場上常用的嗜熱鏈球菌與乳酸桿菌的菌種配方，選用嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌對新鮮椰奶進行混合發酵，將產生全新的風味[18-19]，酸味口感更強，不僅膽固醇含量更低[20]，營養物質更利于人體吸收[11]。因此，本實驗通過優化椰奶發酵條件，為研制出具高活菌數的益生菌飲料提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

新鮮椰子，購于海南文昌；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)與植物乳桿菌(Lactobacillusplantrum)，中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)；葡萄糖和蔗糖(市售，食品級)；乳酸桿菌瓊脂培養基與乳酸桿菌肉湯培養基，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗儀器與設備

冷凍干燥機(FD-1)，北京德天佑科技發展有限公司；恒溫培養振蕩器(UZWY-2102C)，上海智城分析儀器制造有限公司；紫外可見分光光度計(TU-1950)，北京普析通用儀器有限責任公司；電子天平(BSA223S)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9101-2SA)，上海鴻都電子科技有限公司；低速大容量多管離心機(LXJ-IIB)，上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫水浴鍋(XMTE-8112)，上海精宏實驗設備有限公司；循環水式多用真空泵(SHB-III)，武漢世紀超杰實驗儀器有限公司；九陽多功能榨汁機(JYL-C022E)，九陽股份有限公司；膠體磨(CRM-50)，廊坊市成瑞機械設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS)，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；電熱恒溫培養箱(SKP-02.420)，黃石市恒豐醫療器械有限公司

1.3 實驗方法

1.3.1 椰子預處理工藝流程

1.3.2 椰奶制備

取新鮮椰子引流出椰子水，再開椰殼取椰肉，以質量比1∶3加入蒸餾水榨汁，過濾后與椰子水混合，經均質過濾制得新鮮椰奶，呈均勻乳白色，具濃郁椰香，儲存于4 ℃冰箱。

1.3.3 前調配及滅菌

根據嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的最優碳源[21-23]，選擇蔗糖及葡萄糖為前調配輔料[24-25]，根據酸甜口感適量添加。90 ℃，滅菌10 min[8-9]。

1.3.4 菌種活化

商用菌種干粉先用乳酸桿菌肉湯培養基溶解，混勻，在乳酸桿菌瓊脂培養基劃線培養，挑取單菌落于乳酸桿菌肉湯培養基中擴培，37 ℃活化12 h，活化2～3次。取一部分活化后菌液與30%甘油等體積混合均勻，分管保存于-20 ℃。

1.3.5 菌粉及菌液制備

取另一部分活化的種子液加入3 L乳酸桿菌肉湯培養基中擴培16 h，隨后將菌液在4 000 r/min離心10 min，棄上清取菌泥，加入保護劑配方[26]，于-80 ℃預凍4 h，再真空冷凍干燥48 h。采用平板稀釋涂布法測定菌粉活菌數[27]，其中嗜酸乳桿菌菌粉菌含量達1.8×109CFU/g，植物乳桿菌菌粉菌含量達2.4×109CFU/g。

以滅菌生理鹽水溶解菌粉，適當稀釋后使菌懸液菌體濃度為108CFU/mL，用于椰奶發酵接種。

1.3.6 單因素實驗

以活菌數為評價指標，分別對發酵溫度35、37、39、41、43和45 ℃，發酵時間14、16、18、20、22和24 h，接種量1.5%、3%、4.5%、6%、7.5%、9%與植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌添加比例(Z/S)為0.5、1、1.5、2、2.5進行單因素實驗，采用平板計數法稀釋涂布，在37 ℃下培養48 h，觀察并記錄總菌數，確定各因素的影響效果與適宜范圍。

1.3.7 響應面法實驗因素水平設計

以單因素實驗結果為基礎，采用Design expert-8軟件應用Box-Behnken設計方法，選擇發酵溫度(A)、發酵時間(B)、接種量(C)、菌比例(D)作為響應變量，編碼水平為-1、0和1，且以活菌數(Y)作為響應值，對椰奶的發酵條件進行優化。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 發酵溫度對發酵椰奶的活菌數的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號，分別加入30 mL的滅菌椰奶，適量滅菌糖液，接種等量混合菌液后，分別在35、37、39、41、43、45 ℃下恒溫培養20 h后，采用平板計數法稀釋涂布，在37 ℃下培養48 h，觀察并記錄總菌數，結果如圖1所示。

圖1 發酵溫度對發酵椰奶活菌數的影響

Fig.1 Effects of fermentation temperature on viable count of the coconut milk beverage注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同。

由圖1可以看出，37～43 ℃是嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的較適生長溫度范圍，乳桿菌生長旺盛；39 ℃時總活菌數達到最高，隨后發酵溫度繼續增加，飲料活菌數下降；45 ℃時，菌種生長受明顯抑制。可能是由于在適當的范圍內溫度升高有利于催化各種酶反應[28-29]，提高了乳桿菌增殖速率和發酵產酸速率[1]。因此，基于能量及活菌數的優化考慮，選用發酵溫度為39 ℃為椰奶益生菌飲料最佳發酵溫度。

2.1.2 發酵時間對發酵椰奶活菌數的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，接種等量混合菌液后，在37 ℃下分別恒溫培養14、16、18、20、22和24 h，采用平板計數法稀釋涂布，將涂布后的平板在37 ℃下培養48 h，觀察并記錄總菌數，結果如圖2所示。

圖2 發酵時間對發酵椰奶活菌數的影響

Fig.2 Effects of fermentation time on viable count of the coconut milk beverage

由圖2可以看出，隨著發酵時間的增加，椰奶中的乳桿菌大量增加，18 h時，活菌數達到最大，隨后趨于平緩，再逐漸下降。這可能是因為起初隨著時間增加，營養物質充足，乳桿菌繁殖加快，菌數升高；而隨著時間延長，飲料中的營養物質消耗過多，限制了乳桿菌的生長，其死亡速率超過增殖速率，因此菌數在保持穩定后逐漸下降[3, 13,28，30]。綜合考慮，選擇發酵時間為18 h。

2.1.3 接種量對發酵椰奶的活菌數的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，分別接種1.5%、3.0%、4.5%、6%、7.5%、9%的混合菌液，在37 ℃下恒溫培養20 h，采用平板計數法稀釋涂布，在37 ℃下培養48 h，觀察并記錄總菌數，結果如圖3所示。

圖3 接種量對發酵椰奶活菌數的影響

Fig.3 Effects of f inoculation quantity on viable countof the coconut milk beverage

從圖3可知，隨著接種量的增加，椰奶發酵飲料活菌數呈現逐漸增加的趨勢，當接種量為7.5%時，活菌數達最大值且隨后趨于平緩。這是由于隨著乳桿菌數的增加，乳桿菌對底物利用加快，增殖速率加快；而在有限的發酵營養環境內，乳桿菌對底物的利用水平有限，其增殖速率達到最大值后趨于穩定[31]。因此，基于菌成本和活菌數優化的考慮，選擇椰奶發酵飲料的最佳接種量為7.5%。

2.1.4 菌種添加比例對發酵椰奶活菌數的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，接種菌比例(Z/S)分別0.5、1.0、1.5、2.0和2.5的等量混合菌液后，在37 ℃下恒溫培養20 h，采用平板計數法稀釋涂布，在37 ℃下培養48 h，觀察并記錄總菌數，結果如圖4所示。

圖4 菌比例(Z/S)對發酵椰奶活菌數的影響

Fig.4 Effects of f bacteria ratio(Lactobacillus plantarum/Lactobacillus acidophilus)on viable count of the coconut milk beverage

由圖4可知，隨著菌比例(Z/S)的增加，椰奶益生菌飲料活菌含量先增加后減少，當菌比例(Z/S)為1～1.75時，飲料活菌含量保持較高的水平；當菌比例(Z/S)為1.5時活菌數達到最大值，繼續增加菌比例(Z/S)，活菌含量下降。這可能是因為當植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌的比例接近時，產生的競爭抑制較小，對營養底物的利用實現較平衡的優化，由于嗜酸乳桿菌產酸及耐酸綜合能力更強[32-33]，因此，選擇菌比例為(Z/S)為1.5。

2.2 Box-Behnken實驗設計

2.2.1 根據單因素實驗結果

響應面實驗因素編碼及水平設計見表1。

表1 響應曲面實驗因素水平設計

2.2.2 模型建立與顯著性檢驗

綜合單因素結果，選擇發酵溫度(A)、發酵時間(B)、接種量(C)、菌比例(Z/S)(D)4個因素，通過4因素3水平的Box-Behnken實驗設計和響應面分析方法，確定椰奶發酵最佳工藝條件，所得實驗方案與結果見表2。

表2 響應面分析實驗方案與結果

續表2

實驗號各因素編碼值ABCD活菌數×10-8/(CFU·mL-1)1700111.8018-10102.211901011.762001-101.82210-1101.82220-1101.76231-1001.7724-10012.2025-11002.332610011.572700001.852800001.81290-1011.56

以活菌數(Y)為響應值，應用Design expert-8軟件進行多元回歸擬合分析，各實驗因素對響應值的影響可用如下多元二次回歸方程表示：

Y=1.83-0.17A+0.058B+0.080C-0.029D-0.16AB-0.023AC-0.14AD-0.088BC+0.072AD+5.000E-003CD+0.13A2-0.070B2-0.031C2-0.054D2

(1)

2.2.3 響應因素水平的優化及模型驗證

通過Design expert-8軟件分析得到椰奶發酵的最佳條件為：發酵溫度(A)為41 ℃、發酵時間(B)為18 h、接種量(C)為9%、菌比例(Z/S)(D)為1。采用此優化條件進行發酵椰奶驗證實驗，重復3次，椰奶飲料活菌數含量達2.011×108CFU/mL，與預測值相近，重復性好，表明此模型能較好地優化得到椰奶發酵最佳條件。

表3 響應面分析實驗方差分析結果

續表3

方差來源自由度平方和均方F值P值顯著性D210.0190.0197.220.017 7?殘差140.0372.614E-003失擬項100.0343.423E-0035.800.052 5殘差140.0372.61E-03失擬項100.0343.42E-035.80.0525純誤差42.362×10-35.904×10-4總和280.930.064R2=96.08%RMSE=0.051CV=2.81

由表3可知，該模型效應極顯著(P<0.01)。該模型的決定系數為96.08%，修正決定系數為92.16%；模型的變異系數CV=2.81，模型變異較小；模型的失擬項差異不顯著，說明回歸方程擬合程度高，可用于椰奶發酵條件的優化。該模型的一次項A、C、二次項A2和AB、AD是極顯著項，B、BC、B2和D2是顯著項，其他為非顯著項。因素D的P值為0.069 6>0.05，說明菌比例(Z/S)對活菌數影響不顯著。影響椰奶發酵優化條件的因素順序為:發酵溫度>接種量>發酵時間>菌比例(Z/S)。

3 結論

本文對發酵椰奶活菌數條件進行了響應面優化。以新鮮椰子為原料，嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌為菌種，優化椰奶發酵飲料活菌數最佳工藝條件為：發酵溫度為41 ℃、發酵時間為18 h、接種量為9%、菌比例(Z/S)為1，椰奶飲料活菌數含量達2.011×108CFU/mL。現行國標中關于活性乳酸菌數值的指標要求為出廠時不小于100萬個/mL，遠低于1 000萬個/mL的國際標準。該款椰奶飲料活菌數不僅遠高于市場標準，也達到了國際乳酸菌類飲料活菌數標準。另外，發酵后的椰奶保留了較純正的椰香，顏色偏乳白色，口感細膩，質地均勻，有利于進一步市場利用與開發。

由于本款椰奶發酵飲料僅添加了蔗糖與葡萄糖做輔料，口味純正較單一，酸味強，發酵終點pH在3.32～3.49，在實際生產中，可將在此條件下發酵的椰奶適當稀釋，有利于降低成本，提高經濟效益；另外，可針對市場需求，添加多種不同輔料以創新更豐富的口感。綜上所述，本文針對椰奶益生菌飲料生產工藝的活菌數優化實驗，對開發椰奶發酵產品提供了良好的參考意義及廣闊的市場前景。