新型芹菜素納米脂質(zhì)體對糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

章雅丹

(寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院藥劑科，寧波 315040)

糖尿病已經(jīng)成為危害人類健康的重大疾病之一[1-2]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷引起的心臟結(jié)構(gòu)以及功能的障礙，已經(jīng)成為患者致死的主要原因[3]。糖尿病引起的高血糖、高脂血癥可以造成心肌細(xì)胞凋亡，是DCM的主要病理特征之一，可進(jìn)一步引起左心室功能紊亂以及心肌細(xì)胞纖維化[4]。研究顯示，芹菜素能夠顯著降低糖尿病動(dòng)物血糖及血脂水平，是潛在的防治DCM的藥物[5]。然而，由于其存在溶解性低、在體應(yīng)用難吸收等問題限制了臨床應(yīng)用[6]。脂質(zhì)體是一種新型的被動(dòng)靶向藥物遞送載體，應(yīng)用脂質(zhì)體包載難溶性藥物，能夠提高藥物溶解度，同時(shí)促進(jìn)藥物的細(xì)胞膜滲透性，增加藥物的吸收[7-8]，從而實(shí)現(xiàn)難溶性藥物在體臨床應(yīng)用。筆者制備新型納米脂質(zhì)體包載難溶性藥物芹菜素，考察其對于DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡的預(yù)防作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為180～220 g，清潔級(jí)，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2015-0001，合格證號(hào)：wydw2013-0050，飼養(yǎng)條件符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南。

1.2主要試劑 芹菜素(Sigma-Aldrich 公司，含量≥99%，CAS號(hào)：520-36-5)，注射級(jí)蛋黃卵磷脂(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，CAS號(hào)：93685-90-6)，戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich 公司，CAS號(hào)：57-33-0)，鏈脲佐菌素(Sigma-Aldrich 公司，CAS號(hào) ：18883-66-4)，TUNEL凋亡試劑盒(Roche Applied Science，批號(hào)：11684795910)，Bcl-2蛋白(Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)：sc-71957)以及Bax一抗(Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)：sc-70407)，辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔二抗(Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)：sc-2004)，血糖試紙(德國羅氏活力型血糖儀專用試紙，批號(hào)：Accu-Chek Performa test strips)。

1.3芹菜素納米脂質(zhì)體的制備及其性質(zhì)考察 參考JIN等[9]介紹的方法制備新型芹菜素納米脂質(zhì)體：芹菜素1 mg，蛋黃卵磷脂10 mg，加入到處方量無水乙醇中完全溶解，將上述溶液在真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙醇，形成載藥脂質(zhì)薄膜，然后加入適量純化水水化12 h，形成膠體溶液。將上述膠體溶液在室溫(25 ℃)及高壓(73.5 MPa)條件下，超聲分散15 s(循環(huán)3次)，制備芹菜素納米脂質(zhì)體。應(yīng)用上述方法同時(shí)制備空白納米脂質(zhì)體。

采用掃描電子顯微鏡考察載藥脂質(zhì)體表觀形態(tài)，同時(shí)應(yīng)用動(dòng)態(tài)光衍射法測定載藥及空白脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位分布。

包封率測定：將上述制備載藥脂質(zhì)體溶液放入透析袋(截留相對分子質(zhì)量10 000～12 000)，室溫透析2 h，除去未包封藥物及他制備輔料。然后甲醇破壞脂質(zhì)體，應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)法測定載藥脂質(zhì)體中藥物含量。

載體包封率(%)=載藥脂質(zhì)體中藥物含量/最開始加入藥物×100%。

1.4糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及給藥方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為正常對照組、模型對照組、空白脂質(zhì)體組、芹菜素脂質(zhì)體組，每組15只。飼養(yǎng)1周后，參考ZHAO等[10]介紹的方法建立大鼠1型糖尿病模型，腹腔注射1%鏈脲佐菌素(70 mg·kg-1)，正常對照組腹腔注射同劑量0.9%氯化鈉溶液。于注射后第3天、第7天以及第14天尾靜脈取血測定血糖。3次測定結(jié)果均大于16.7 mmol·L-1且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物明顯出現(xiàn)多飲、多食、多尿以及體質(zhì)量下降等現(xiàn)象即說明造模成功。此后芹菜素脂質(zhì)體組尾靜脈給予芹菜素納米脂質(zhì)體(30 μg·kg-1)，空白脂質(zhì)體組尾靜脈給予等劑量空白納米脂質(zhì)體，每周3次，持續(xù)給藥12周。模型對照組以及正常對照組每周尾靜脈給予同劑量0.9%氯化鈉溶液。12周之后處死大鼠，迅速開胸，取出心臟，在左心室中部沿橫軸切取厚度為0.5 cm的心肌組織，放置在4%多聚甲醛中，剩余心肌細(xì)胞-80 ℃保存。

1.5心肌細(xì)胞TUNEL染色 按照羅氏TUNEL凋亡試劑盒說明書，將組織切片脫蠟、乙醇梯度浸洗，Proteinase K工作液透化，在切片上加TUENEL反應(yīng)液，蓋膜，37 ℃孵育60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，DAB室溫顯色10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，乙醇梯度脫水、透明和封片，于光鏡下觀察，每只大鼠做切片3張，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)無重疊、具有代表性的5個(gè)400倍視野，以平均每100個(gè)細(xì)胞核中含凋亡細(xì)胞的數(shù)量作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

1.6Western blotting檢測 將組織從-80 ℃冰箱中取出，在裂解緩沖液中勻漿，4 ℃離心，取上清液，高速離心，沉淀用Triton X-100緩沖液1 mL溶解，二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白濃度備用。

每組按20 μg蛋白的溶液體積上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓設(shè)為90 V，根據(jù)Maker移動(dòng)情況適時(shí)終止電泳。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，加入1：5000稀釋的Bax以及Bcl-2一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加二抗室溫孵育1 h。以β-actin為參照，DAB顯色后應(yīng)用凝膠成像分析儀分析。

2 結(jié)果

2.1芹菜素納米脂質(zhì)體的性狀表征 掃描電鏡觀察空白及載藥納米脂質(zhì)體如圖1所示，空白及載藥納米脂質(zhì)體的形態(tài)圓整、分散性好、無粘連。動(dòng)態(tài)光衍射法測定載藥及空白脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位分布結(jié)果顯示：空白及載藥納米脂質(zhì)體的平均粒徑分別(98.3±1.3)和(103.4±1.2) nm，說明載藥前后納米脂質(zhì)體的粒徑無明顯變化。同時(shí)空白及載藥納米脂質(zhì)體的多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)分別為0.102和0.108，均<0.2，說明載藥及空白納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性好，粘連少。Zeta電位測定結(jié)果顯示：空白及載藥納米脂質(zhì)體的Zeta電位分別為(-23.8±1.6)和(19.8±1.3)mV，絕對值均大于15 mV。包封率是評(píng)價(jià)納米載體的重要質(zhì)量指標(biāo)，本次研究制備的納米脂質(zhì)體的包封率測定結(jié)果為(93.42±3.41)%，說明新型納米脂質(zhì)體能夠較好地實(shí)現(xiàn)對于芹菜素的包載。

2.2心肌細(xì)胞TUNEL凋亡染色結(jié)果 各組實(shí)驗(yàn)大鼠TUNEL染色結(jié)果見圖2所示：正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色，箭頭所示為凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核。與正常對照組比較，模型對照組大鼠及空白脂質(zhì)體干預(yù)組12周之后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型對照組及空白脂質(zhì)體組比較，經(jīng)過連續(xù)12周芹菜素脂質(zhì)體治療的實(shí)驗(yàn)大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平顯著下降(P<0.05)。

A.空白納米脂質(zhì)體；B.芹菜素納米脂質(zhì)體

A.blank nanoliposomes；B.apigenin-loaded nanoliposomes

Fig.1Blankanddrug-loadednanoliposomesobservedbyscanningelectronmicroscope

2.3心肌細(xì)胞Western blotting檢測結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的Western blotting結(jié)果分析如圖3所示。與正常對照組比較，糖尿病大鼠及空白納米脂質(zhì)體干預(yù)大鼠心肌凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2顯著降低(P<0.01)，Bax顯著升高(P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.空白脂質(zhì)體組；D.芹菜素脂質(zhì)體組。與正常對照組比較，*1P<0.05；與芹菜素脂質(zhì)體組比較，*2P<0.05

圖2 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(n=15)

A.normal control group；B.model control group；C.blank nanoliposome group；D.apigenin loaded nanoliposome group.Compared with normal control group,*1P<0.05；compared with apigenin-loaded nanoliposome group,*2P<0.05

Fig.2Myocardialapoptosisinfourgroupsofrats(n=15)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.空白脂質(zhì)體組；D.芹菜素納米脂質(zhì)體組。與正常對照組比較，*1P<0.01；與芹菜素脂質(zhì)體組比較，*2P<0.01

圖3 4組大鼠心肌Bcl-2及Bax的表達(dá)情況(n=15)

A.normal control group；B.model control group；C.blank nanoliposome group；D.apigenin-loaded nanoliposome group.Compared with normal control group,*1P<0.01；compared with apigenin-loaded nanoliposome group,*2P<0.01

Fig.3ExpressionofBcl-2andBaxinmyocardiuminfourgroupsofrats(n=15)

與模型對照組大鼠及空白納米脂質(zhì)體組比較，芹菜素納米脂質(zhì)體治療組的心肌Bcl-2含量顯著升高(P<0.01)，Bax含量顯著降低(P<0.01)。

3 討論

糖尿病引起的高血糖能夠通過氧化應(yīng)激損傷及Bax途徑等誘導(dǎo)患者心肌細(xì)胞凋亡，加重DCM的進(jìn)程[11-12]，最終導(dǎo)致患者死亡。芹菜素是一種天然的抗氧化劑[13]，能夠改善脂肪肝患者的血脂異常以及肥胖型糖尿病動(dòng)物的的胰島素抵抗，降低其血糖水平[14]。同時(shí)芹菜素還能夠顯著降低缺血-再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平[15]。然而芹菜素存在溶解度低及在體吸收差等生物藥動(dòng)學(xué)參數(shù)缺陷，限制了其臨床應(yīng)用。

載體質(zhì)量考察結(jié)果顯示，空白及載藥納米脂質(zhì)體的形態(tài)圓整，載藥前后形態(tài)無明顯變化。多分散系數(shù)PDI均小于0.2，說明本次實(shí)驗(yàn)制備的載藥納米脂質(zhì)體分散性好，粘連少。粒徑分析及Zeta電位測定顯示，載藥及空白納米脂質(zhì)體的粒徑接近100 nm，Zeta電位絕對值均大于15，說明載藥及空白納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性好[16]。另外包封率測定結(jié)果顯示：芹菜素納米脂質(zhì)體的包封率高，說明采用薄膜水合結(jié)合超聲分散法能夠較好地實(shí)現(xiàn)對于芹菜素的包載。

12周之后模型對照組大鼠及空白脂質(zhì)體干預(yù)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組(P<0.05)，說明各組大鼠DCM動(dòng)物模型成功，其心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。而經(jīng)過芹菜素納米脂質(zhì)體持續(xù)干預(yù)12周之后的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于模型對照組大鼠(P<0.05)，接近正常水平，說明芹菜素脂質(zhì)體能夠有效降低DCM引起心肌凋亡。

另外，本次實(shí)驗(yàn)研究還初步考察了芹菜素納米脂質(zhì)體對于降低DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平的作用機(jī)制。研究表明，在目前已知的凋亡調(diào)節(jié)蛋白中，Bcl-2蛋白家族在各類刺激信號(hào)引起的凋亡中起到關(guān)鍵作用。Bcl-2和Bax蛋白水平的高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)，Bax升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2增高，抑制細(xì)胞凋亡[17]。本次研究應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測了各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2及Bax的蛋白含量。結(jié)果顯示，模型對照組大鼠及空白納米脂質(zhì)體組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax含量顯著提高(P<0.01)，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2含量顯著降低(P<0.01)；與糖尿病及空白納米脂質(zhì)體組大鼠比較，經(jīng)過劑量芹菜素納米脂質(zhì)體干預(yù)后的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2含顯著升高(P<0.01)，而Bax含量顯著下降(P<0.01)，說明芹菜素納米脂質(zhì)體可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax途徑降低DCM大鼠的心肌細(xì)胞凋亡水平。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了芹菜素納米脂質(zhì)體能夠有效抑制糖尿病引起的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，為臨床DCM患者的防治提供了一種新的思路。