3-羥基丁酸對HeLa癌細胞生長與凋亡的影響*

蘇佳佳, 曾 杰, 邵鄰相

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

生酮飲食對人乳腺癌[1]、神經性母細胞瘤[2]、結腸癌[3]、前列腺癌[4]和胃癌[5]等腫瘤具有明顯的治療效果,通過逆轉基因表達模式、降低活性氧的水平、抗血管生成和抗炎等作用抑制腫瘤生長,延長患癌動物生存時間[6-9].生酮飲食產生酮體,包括3-羥基丁酸、乙酰乙酸和丙酮等,其中起主要作用的成分是3-羥基丁酸.3-羥基丁酸能夠誘導胰腺癌細胞凋亡[10],但3-羥基丁酸在細胞水平上抑制癌細胞增殖方面的研究報道甚少.

腫瘤細胞從胞外環境攝取的葡萄糖的量是正常細胞的十幾倍[11]．大量攝取葡萄糖為腫瘤細胞生長提供了充足的能量；糖尿病患者患癌風險比普通人高25%以上[1]，患胰腺癌風險比普通人高5倍以上[12].因此，葡萄糖饑餓的癌癥治療方法受到人們廣泛關注．實驗室前期工作表明，碳源饑餓能抑制HeLa細胞的增殖與生長，誘導HeLa細胞的凋亡[13-16]；并且HeLa癌細胞與人體臍帶正常細胞在葡萄糖饑餓共培養條件下，HeLa癌細胞先于正常細胞凋亡，這為臨床上饑餓療法治療腫瘤提供了理論依據.饑餓療法或道家服氣辟谷期間機體處于較低的血糖水平(空腹血糖)，人體動用脂肪在肝臟產生酮體(如3-羥基丁酸)，進入血液給機體細胞提供能量.為模擬人體環境，實驗設計了相當于人體空腹血糖條件下，用3-羥基丁酸處理HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞共培養組作為對照組，觀察3-羥基丁酸對人體正常細胞生長的影響.探討了3-羥基丁酸抑制HeLa癌細胞生長的作用與誘導HeLa癌細胞凋亡的機制,為腫瘤的生酮飲食療法和酮體療法提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

3-羥基丁酸為杭州昊天生物技術有限公司產品;caspase-3,Bim,Bad兔抗體,P27鼠抗體為Cell Signaling Technology公司產品;HRP-標記山羊抗兔IgG,HRP-標記山羊抗小鼠IgG,HRP-GAPDH-mAb為Bioworld Technology公司產品;其他常規試劑均為金華醫藥公司產品.

流式細胞儀為美國BD公司產品;半干轉蛋白印跡系統為Bio-Rad公司產品;全自動化學發光成像分析系統為上海天能科技有限公司產品.

1.2 HeLa癌細胞培養和細胞活力檢測

G25K0組:25 mmol/L葡萄糖+0 mmol/L 3-羥基丁酸組;G5K0組:5 mmol/L葡萄糖+0 mmol/L 3-羥基丁酸組;G5K25組:5 mmol/L葡萄糖+25mmol/L 3-羥基丁酸組;G25K25組:25 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L 3-羥基丁酸組.HeLa癌細胞培養和細胞活力檢測實驗方法參照文獻[15].

1.3 單細胞凝膠電泳檢測 DNA 損傷

3-羥基丁酸處理HeLa癌細胞48 h,收集細胞.單細胞凝膠電泳實驗方法參照文獻[17].

1.4 流式細胞分析

3-羥基丁酸處理HeLa癌細胞48 h后,胰酶消化,離心,用PBS沖洗2遍,每組細胞加入1×Annexin V結合緩沖液,調整細胞密度為1×106個/mL,分別取400 μL重懸液加入到1.5 mL EP管中.G25K0組分別用單染(10 μL 20 μg/mL Annexin V),單染(5 μL 50 μg/mL PI),雙染(10 μL Annexin V+5 μL PI),陰性空白染色(無Annexin V和 PI);實驗組G25K25組雙染(10 μL Annexin V+5 μL PI).室溫避光孵育15 min后 ,1 h內完成流式細胞檢測.數據采用Flow Jo 7.6軟件進行處理.

1.5 Western Blot 檢測蛋白表達

3-羥基丁酸處理HeLa癌細胞48 h后,收集細胞,提取總蛋白.Western Blot 檢測實驗方法參照文獻[18].

1.6 統計分析

應用 SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析,以P<0.05為統計學顯著性差異.

2 結 果

2.1 3-羥基丁酸對HeLa癌細胞活力的影響

為了檢測3-羥基丁酸對HeLa癌細胞活力的影響,利用MTT法檢測腫瘤細胞的生長,結果如表1所示:G5K0組,G5K25組和G25K25組3-羥基丁酸處理HeLa癌細胞后增殖抑制率,24 h時分別為10.2%,41.4%,1.2%;48 h時分別為28.8%,65.1%,12.6%;72 h時分別為51.2%,66.3%,17.8%.以上結果表明3-羥基丁酸能夠降低HeLa癌細胞活力,且呈時間依賴性;在低葡萄糖條件下,3-羥基丁酸對抑制HeLa癌細胞活力的作用更明顯(見表1).

2.2 AO/EB熒光染色檢測3-羥基丁酸對HeLa癌細胞凋亡的影響

表1 3-羥基丁酸對HeLa癌細胞活力的影響

注：*P< 0.05為差異有顯著性統計學意義,**P< 0.01為差異有極顯著性統計學意義.

利用AO/EB熒光染色實驗檢測3-羥基丁酸對HeLa癌細胞凋亡程度的影響.G25K0組細胞利用AO/EB熒光染色實驗檢測3-羥基丁酸對HeLa癌細胞凋亡程度的影響.G25K0組細胞(見圖1A)為分布均勻的綠色,細胞膜與細胞核完整,細胞呈多邊形或梭形,邊界清晰;G5K0組細胞(見圖1B)大多數為分布均勻的綠色,僅有極少數細胞皺縮變圓,呈典型的早期凋亡特征；G5K25組細胞(見圖1C)密度明顯減小,大多數細胞收縮變圓,細胞為橘紅色,出現凋亡小體,呈典型的晚期凋亡特征；G25K25組細胞(見圖1D)密度明顯減小,多數細胞呈橢圓形,少數細胞為淡橘色,出現凋亡小體,呈典型的中期凋亡特征.結果表明，3-羥基丁酸能夠抑制HeLa癌細胞增殖,誘導HeLa癌細胞凋亡;在低葡萄糖條件下,3-羥基丁酸誘導HeLa癌細胞凋亡的作用更明顯.

A:G25K0組;B:G5K0組;C:G5K25組;G25K25組

圖1 AO/EB熒光染色檢測3-羥基丁酸誘導HeLa癌細胞凋亡

2.3 3-羥基丁酸對HeLa癌細胞DNA的損傷

為了進一步探究3-羥基丁酸抑制腫瘤細胞生長的細胞生物學機制,采用單細胞凝膠電泳法檢測腫瘤細胞DNA的受損情況.如圖2所示,G25K0組細胞(見圖2A)的彗星頭熒光強,細胞核在電場的作用下仍較圓,極少彗尾形成,細胞核DNA保持完好未受到損傷;G5K0組細胞(見圖2B)在電場的作用下,細胞核DNA有少量跑出,造成輕微的拖尾現象,彗星頭大小不均一,細胞核DNA受到輕微的損傷;G5K25組細胞(見圖2C)在電場作用下,彗星頭明顯縮小甚至消失,彗尾長,細胞核DNA受到嚴重損傷;G25K25組細胞(見圖2D)在電場的作用下,分子量大小不等的DNA片段跑出細胞核,彗星頭明顯縮小,形成細長的彗尾,呈扇形散開,細胞核DNA受到損傷,但損傷程度低于G5K25組細胞.CASP彗星分析軟件進行數據分析，結果如表2所示.與G25K0組相比較,G5K0組、G25K25組和G5K25組彗星頭部DNA含量百分比(HDNA%)逐漸減少(P<0.01),尾部DNA含量百分比(TDNA%),彗星全長(CL),彗星尾長(TL),尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)都明顯增多(P<0.05).

這些結果均表明，HeLa癌細胞經3-羥基丁酸處理后,細胞核DNA受到損傷,可能引起細胞凋亡的發生;在低葡萄糖條件下,HeLa癌細胞經3-羥基丁酸處理后,細胞核DNA損傷程度增加.

2.4 流式細胞儀檢測3-羥基丁酸對HeLa癌細胞凋亡的影響

通過流式細胞凋亡實驗檢測3-羥基丁酸對HeLa癌細胞凋亡的影響,結果如圖3所示.G25K0組與G25K25組的早期凋亡率分別為2.74%和24.80%;晚期凋亡率分別為1.79%和14.90%.因此,G25K25組細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加.

A:G25K0組;B:G5K0組;C:G5K25組;G25K25組圖2 單細胞凝膠電泳檢測DNA的損傷表2 單細胞凝膠電泳檢測細胞DNA鏈斷裂的各項指標

注：*P< 0.05為差異有顯著性統計學意義,**P< 0.01為差異有極顯著性統計學意義.

圖3 流式細胞儀檢測3-羥基丁酸對HeLa癌細胞凋亡的影響

2.5 Western Blot檢測細胞凋亡相關蛋白的表達

Western Blot檢測3-羥基丁酸對HeLa癌細胞凋亡相關蛋白的表達.結果表明,HeLa癌細胞經3-羥基丁酸處理48 h,與G25K0組相比,G25K25組、G5K0組和G5K25組caspase-3主帶蛋白含量逐漸減少,灰度值分別減少10.63%,38.95%,52.04%,與G25K0組相比具有極顯著性差異(P<0.01);G5K0組,G5K25組中促凋亡蛋白Bim表達量逐漸增多,G25K0組與G5K25組比較具有極顯著性差異(P<0.01);與G25K0組相比,G25K25組、G5K0組和G5K25組Bad蛋白表達量均有增多,具有顯著性差異(P<0.05)(見圖4和表3).說明3-羥基丁酸可以通過caspase依賴性細胞凋亡途徑誘導HeLa癌細胞凋亡.

圖4 3-羥基丁酸處理后凋亡相關蛋白的表達量

表3 3-羥基丁酸對HeLa癌細胞蛋白表達的影響

注：*P< 0.05為差異有顯著性統計學意義,**P< 0.01為差異有極顯著性統計學意義.

2.6 3-羥基丁酸對共培養的HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞的影響

上述結果表明，3-羥基丁酸能夠抑制HeLa癌細胞增殖,誘導細胞凋亡.為檢測3-羥基丁酸對人體正常細胞的生長情況,設計了HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞共培養的實驗.結果顯示:G25K0組人臍帶正常細胞和HeLa癌細胞為分布均勻的綠色熒光,細胞生長良好(見圖5A1～A2).G5K0組人臍帶正常細胞少數細胞收縮變圓為橘紅色,半數細胞為綠色(見圖5B1);而HeLa癌細胞多數細胞收縮變圓,為淡橘紅色,呈典型的中期凋亡特征,僅有少數細胞為綠色(見圖5B2).G5K25組人臍帶正常細胞大多數細胞染色為分布均勻的綠色,僅少數細胞為橘紅色,呈早期凋亡特征(見圖5C1);而HeLa癌細胞密度明顯降低,大多數細胞為橘紅色,呈明顯的晚期凋亡特征,僅有極少數細胞為不明顯的綠色,表明細胞狀態差,大部分細胞已凋亡(見圖5C2).G25K25組人臍帶正常細胞為分布均勻的綠色熒光,極少數細胞為橘紅色(見圖5D1);而HeLa癌細胞密度減少,一些細胞為不明顯的綠色熒光,一些細胞為橘紅色,表明細胞狀態差,部分細胞已凋亡(見圖5D2).結果表明,在共培養條件下,3-羥基丁酸誘導HeLa癌細胞先于人臍帶正常細胞凋亡.

A1～A4:人臍帶正常細胞;B1～B4:HeLa癌細胞

圖5 AO/EB熒光染色檢測3-羥基丁酸對共培養的HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞的影響

3 討 論

惡性腫瘤的發生與能量代謝異常密切相關.正常細胞可以利用葡萄糖、脂肪酸和酮體提供能量;腫瘤細胞在有氧條件下以糖酵解作為主要產能方式[19],并且腫瘤細胞線粒體缺乏利用酮體供能的一種或多種關鍵酶,從而導致腫瘤細胞更依賴葡萄糖供能且不能利用酮體供能[19-20].

生酮飲食是一種由高比例脂肪、適量蛋白質、低碳水化合物及其他營養素組成的飲食.生酮飲食中脂肪含量占70%以上,在體內分解產生3-羥基丁酸.生酮飲食中起主要作用的成分是3-羥基丁酸.

用3-羥基丁酸處理HeLa細胞后，MTT檢測表明，3-羥基丁酸能夠降低HeLa癌細胞活力;AO/EB熒光染色、單細胞凝膠電泳和流式細胞儀檢測都表明，3-羥基丁酸能夠抑制HeLa癌細胞增殖,誘導HeLa癌細胞凋亡.Shukla等[10]用3-羥基丁酸處理人胰腺癌細胞,研究表明,3-羥基丁酸能夠抑制胰腺癌細胞增殖,誘導細胞凋亡.該實驗結果與Shukla等[10]研究結果一致.

促凋亡蛋白Bim從微管蛋白復合體上釋放出來并移位于線粒體外膜,促凋亡蛋白Bad位于胞質,移位并插入線粒體外膜;Bim和Bad最終通過caspase-3依賴的細胞有絲分裂障礙而誘導細胞凋亡.3-羥基丁酸處理HeLa癌細胞后與G25K0組相比,G5K25組Bim蛋白表達上調41.23%;G25K25組、G5K0組和G5K25組Bad蛋白表達分別上調36.19%,140.95%,119.52%(見表3),從而誘導HeLa癌細胞凋亡.在細胞凋亡啟動時,caspase-3需要從沒有活性的全長caspase-3(35 kD)被剪切成17 kD的肽段而被激活;3-羥基丁酸處理HeLa癌細胞后與G25K0組相比,G25K25組,G5K0組和G5K25組caspase-3主帶蛋白含量分別減少10.63%,38.95%,52.04%,說明caspase-3蛋白主帶(35 kD)發生剪切而被激活,從而誘導HeLa癌細胞凋亡.綜上所述,3-羥基丁酸可以通過caspase依賴性細胞凋亡途徑誘導HeLa癌細胞凋亡.

癌癥患者體內癌細胞數量占比少,而正常細胞數量占絕大多數.雖然3-羥基丁酸能夠抑制HeLa癌細胞增殖,誘導細胞凋亡.但是3-羥基丁酸對人體正常細胞是否會產生副作用,由此進行了HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞共培養的驗證實驗.在共培養條件下,HeLa癌細胞組與人臍帶正常細胞組相比,細胞密度減少、生長狀態差、活力降低,HeLa癌細胞先于人臍帶正常細胞凋亡.以上結果為癌癥治療提供了一個有益的治療靶向,通過這一靶向作用既可以誘導腫瘤細胞的凋亡,又能較少損傷正常的健康組織,為腫瘤的生酮飲食療法和酮體療法提供理論依據.這也為饑餓療法或道家服氣辟谷(較低空腹血糖，較高的3-羥基丁酸)治療腫瘤提供了理論上的依據.