副雞禽桿菌感染PCR診斷及臨床藥物防治比較試驗

文正常 王璇 吳玙彤 吳仙 潘淑惠* 胡偉

（1，貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所 550005；2，貴州苗疆生態農業開發有限公司 556300）

副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum）感染在養雞生產中俗稱雞傳染性鼻炎，主要以甩鼻、鼻竇急性炎性腫脹、急性敗血性死亡為主要臨床表現。近年來，該病在蛋雞及肉雞群中發生頻率不斷增高，已逐步成為貴州地區危害養雞生產的一種主要常發性疫病。發病初期，由于特異性臨床癥狀不顯著，極易誤診為慢性呼吸道疾病，因用藥誤差導致病程延誤，發病雞群產蛋率急劇下降和急性死亡，給養雞場帶來較大經濟損失。由于近年來養雞生產上抗生素、磺胺類藥物的不規范使用，其耐藥性較為明顯，如處置方法不當，致使該病在短期內難以得到有效控制且極易復發。同時，因藥物對致病菌的抑制作用往往給病原分離鑒定帶來一定困難。為此，近年來，我們將PCR 擴增技術用于副雞禽桿菌感染的診斷，提高了診斷的準確性，給處置方案的制定和疾病控制贏得時間。同時，根據其臨床病理特性先后用不同藥物處置方案對其防治效果進行評估，篩選出最佳優化防治技術方案，在及時有效控制疫病的同時，也有利于雞群在短期內生產（生長）性能的恢復。現將其診斷及藥物防治臨床試驗情況給予報道，供同業者借鑒。

1 發病情況及臨床病理特性

蛋雞多發生于50～85日齡育成階段和產蛋高峰期，肉雞常見于中大雞且季節性氣溫多變時高發。發病早期多呈現“甩鼻”為主的慢性呼吸道癥狀，個別患雞鼻孔周邊有漿液性滲出，少量凝固呈棕褐色，很難與雞毒支原體引起的雞慢性呼吸道病進行臨床鑒別；隨著發病時間的延長（4～5d），部分患病雞鼻竇部呈現急性炎性腫脹（圖 1、圖2），晚間呼吸啰音明顯，采食量逐步下降；蛋雞產蛋量下降明顯，畸形蛋顯著增多，雞群呈現急性死亡，雞冠和鼻竇眶周邊組織發紺，重者口腔內有大量灰乳色膿性分泌物滲出；剖檢鼻竇腔內見大量灰白色豆渣樣炎性分泌物沉積（圖3），部分從咽喉到口腔部充滿大量灰白色膿性分泌物（圖4）；發病中期肺組織呈炎性水腫、充血，腸道炎癥變化明顯，拉黃綠色混合稀便；肝、脾、腎等主要臟器無顯著炎性變化。

2 PCR診斷

2.1 試驗材料

2.1.1 試驗病料

試驗用心臟血液、心包液、鼻竇腔分泌物、鼻竇組織等主要病料采集至疑似患病雞只。

2.1.2 主要試驗試劑

胎牛血清購自浙江天抗生物科技有限公司；GoldView I 型核酸染色劑、Tris、EDTA 等購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白大豆瓊脂培養基（TSA）、胰蛋白大豆瓊肉湯（SAB）、DL2000、2×Taq PCR MasterMix（0.05 U Polymerase/μL）、TIANGEN 血液/細胞/組織基因組 DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；苯酚、氯仿、無水乙醇等均為國產試劑。

圖1

圖2

圖3

2.2 試驗方法

2.2.1 細菌培養分離

采集患雞心臟血液、心包液、鼻竇腔分泌物、鼻竇組織，在無菌條件下接種于胰蛋白大豆瓊肉湯培養基37℃厭氧培養24～36h，待細菌生長后再轉培養到胰蛋白大豆瓊脂培養基37℃厭氧培養，選擇性挑取單個菌落再37℃單獨培養，經PCR 擴增檢測，收集目標菌凍存。

2.2.2 PCR 引物

參照陳小玲的方法，將副雞禽桿菌保守片段引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，預期基因片段大小為500bp。

上游引物：5′～TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT～3′；

下游引物：5′～CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT～3′。

2.2.3 基因組提取

分別取分離菌株、眶下竇及鼻腔組織、鼻竇腔炎性分泌物參照TIANGEN 細菌/血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒說明書進行，提取的DNA 于-20℃保存。

2.2.4 PCR 擴增

PCR 反應體系 25μL：2×Taq PCR MasterMix12.5μL，上、下游引物各 1μL，DNA 模板 2μL，用雙蒸水 補足至 25μL。PCR 反應條件：95℃預變性 10min；95℃變性 45s，56℃退火30s，72℃延伸 1min，30個循環；72℃延伸 10min。PCR 產物于4℃保存。擴增產物的檢測：取6μL 擴增產物加入10g/L 瓊脂糖凝膠中電泳 25min 左右（電壓 90V，電流 40～60mA），然后在凝膠成像儀下觀察。

2.2.5 核苷酸序列測定與分析

將PCR 擴增產物送寶生物工程（大連）有限公司進行核苷酸序列測定。

3 不同藥物臨床防治比較試驗

從 2017～2018年，先后用“頭孢噻呋鈉粉”“10%磺胺間鉀氧粉”“孢噻呋鈉粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”“5%恩偌沙星粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”等藥物防治技術方案，按照5d 一個藥物治療流程，對48 批次47.1萬羽不同日齡段的發病雞群進行臨床應用效果比較，對其治愈情況、復發性、死亡率、用藥成本、副反應等指標進行統計分析，綜合評估其應用效果，篩選出較為可靠、穩定的臨床藥物防治方案。

4 試驗結果分析

4.1 PCR擴增

經DNA 產物擴增顯示，細菌及組織樣本均為相近的目的基因擴增條帶，其片段大小均為500bp（圖5），與預期結果相符。

4.2 核苷酸序列分析

經比對，PCR 擴增產物與GenBank 登錄副雞禽桿菌的基因序列重合率為99%，與預期目標一致（圖6），證明擴增片段為副雞禽桿菌基因片段。

4.3 不同藥物方案臨床防治應用效果評價

附表中臨床藥物試驗統計共涉及48 批次、47.1 萬羽發病雞群，其結果顯示，“頭孢噻呋鈉粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”、“5%恩偌沙星粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”兩個藥物治療方案，均兼顧了副雞禽桿菌感染過程中生產雞群呼吸道炎癥及腸道疾病的繼發性感染或混合感染情況，其臨床治療效果及穩定性等均優于“頭孢噻呋鈉粉”和“10%磺胺間鉀氧粉”藥物治療方案，可在一個用藥周期（5d)內快速、有效控制疫病，有利于雞群在短期內生產（生長）性能的恢復。蛋雞的治療效果優于肉雞，主要與蛋雞為舍飼籠養，飼養環境相對穩定，集中用藥時飲水充分，均勻度較好，受到外環境干擾因素相對肉雞較少。

圖5 PCR 擴增產物

圖6 基因序列比對結果

5 討論與小結

（1）在養雞生產中，副雞禽桿菌感染在發病早期多以“甩鼻”為主要臨床表現，其臨床觀察診斷極易與雞毒支原體感染導致的雞“慢性呼吸道”病相混淆，早期誤診和用藥方案不當較為常見，因病程延長極易導致疾病快速爆發和患雞急性死亡。因此，在發病早期必須仔細觀察，當用治療雞“慢性呼吸道”的藥物2～3d 無效或雞群中部分患雞出現鼻孔炎性分泌物增加、鼻竇腫脹等特異性癥狀時，應及時確診或調整用藥方案，避免不必要的經濟損失。

（2）頭孢噻呋鈉粉和磺胺間鉀氧粉是養禽生產上的常用藥物，也是治療副雞禽桿菌感染的首選特異性藥物，當副雞禽桿菌感染雞群發病后，由于藥物使用對病原的抑制性，往往給病原分離鑒定帶來一定困難，因此，PCR 快速診斷技術方法的應用能在較短時間內實現副雞禽桿菌感染的特異性診斷，給治療藥物方案的制定和疾病控制贏得時間，降低了疾病給雞群帶來的經濟損失，也有利用雞群生產（生長）性能的恢復。

附表 發病雞群臨床藥物治療情況統計表

（3）目前，副雞禽桿菌感染性疫病肉雞常見于中大雞且季節性氣溫驟變時多發，蛋雞多發生于青年雞轉群分籠或產蛋高峰期，表明生產（生長）應激和季節性氣溫驟變是其發生的主要誘因。由于多數養雞農戶或養殖場飼養管理經營匱乏，只有當雞群發生大量死亡時才送檢，雞群已處于疫病發生的中后期，呼吸道、腸道繼發感染性疾病明顯，由于生產上頭孢噻呋鈉和磺胺間鉀氧藥物的長期或大劑量使用，形成了一定的耐藥性，在一定程度上限制了藥物作用的有效發揮。因此，在制定藥物治療方案時，要充分兼顧對繼發感染性疾病的控制。48 批次、47.1 萬羽的臨床試驗病案統計分析表明，“頭孢噻呋鈉粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”、“5%恩偌沙星粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”兩個藥物治療方案，是目前能在一個用藥周期（5d) 內快速、有效控制副雞禽桿菌感染的優化方案，也有利于雞群在短期內生產（生長）性能的恢復。同時，在副雞禽桿菌感染發病期，堅持用消毒劑每天帶群消毒，可有效減緩疫病在雞群中的擴散傳播。

（4）應國家對禽蛋產品生產質量安全及獸藥使用規范的要求，在制定藥物治療方案時，恩偌沙星禁止在蛋雞產蛋期使用，對95～135日齡的肉雞應建立休藥期。