黔產朱砂蓮多酚含量及其抗氧化活性研究

茍體忠,劉玉林

(凱里學院 大健康學院，貴州 凱里 556011)

朱砂蓮為馬兜鈴科馬兜鈴屬植物朱砂蓮(Aristolochia tuberosa C.F.Liang et S.M.Huang)(AT)的塊根。分布于貴州、四川、湖北、廣西、云南等地[1]。朱砂蓮主要的化學成分為馬兜鈴酸、生物堿、朱砂蓮素和朱砂蓮苷[1]，具有清熱解毒、消腫止痛等功效[2]，黔東南州苗族和侗族主要用于治療喉痛、胃痛、肺癆、痢疾、蛇傷等。

多酚類物質是植物的重要次生代謝產物，主要有酚酸、黃酮類、木脂素類和單寧[3]。天然源的多酚具有多種生物活性，如抗癌[4]、阿爾茲海默癥[5]、抗氧化[6]、清除自由基[6]等。植物多酚類物質的抗氧化活性一直是國內外學者研究的熱點，然而，朱砂蓮多酚類物質的抗氧化活性研究尚未見文獻報道。因此，本文以朱砂蓮為研究對象，考察朱砂蓮中酚類物質的還原能力和1，1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)清除率，以便為朱砂蓮酚類物質的利用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朱砂蓮(Aristolochia tuberosa C.F.Liang et S.M.Huang)(AT)采自貴州省凱里市雷山縣。特丁基對苯二酚(TBHQ)、福林酚試劑、1，1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)、蘆丁標準品(批號：250249-75-3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、沒食子酸標準品(批號：5995-86-8，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計(UV-2550，日本島津公司)；超聲波清洗機(WH-300，濟寧萬和超聲電子設備有限公司)；離心機(TD5M，長沙湘智離心機儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 朱砂蓮酚類物質的提取

稱取2g朱砂蓮粉末樣品于50 mL離心管中，加入40 mL 70%的乙醇溶液，超聲提取30 min，離心，上層清液轉移至100 mL容量瓶中，用上述步驟將濾渣再處理1次，并用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，待測。

1.3.2 沒食子酸標準曲線的制備

采用Folin﹠ciocalteu's 比色法[7]測定，準確稱取沒食子酸粉末125 mg于1000 mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度，得0.125mg·mL-1標準溶液。用移液槍分別吸取1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0 ，5.0 mL的標準溶液于5個25 mL比色管中，依次加入福林酚試劑1.0 mL、10% Na2CO3溶液6.0 mL，并用超純水定溶至刻度，搖勻，置于暗室中2 h，并在760 nm波長下測定其吸光度值。以沒食子酸濃度(C)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為：A=115.62C+0.025，r=0.9999。

1.3.3 朱砂蓮總多酚的測定

取朱砂蓮提取液0.2 mL于25mL比色管中，按1.3.2步驟測定其吸光度，并根據線性回歸方程計算提取液總多酚的濃度，再由如下公式計算朱砂蓮總多酚的含量。

朱砂蓮總多酚含量(mg·g-1)=(C×VB×VT)·(VR×W)-1

式中：C為反應體系溶液的總多酚濃度(mg·mL-1)；VB為比色管量程(25mL)；VT為提取液總體積(100mL)；VR為反應體系中提取液體積(0.2 mL)；W為朱砂蓮質量(g)。

1.3.4 蘆丁標準曲線的制備

采用硝酸鋁比色法測定[8]，準確稱取0.26 g蘆丁于1000 mL容量瓶中，并用70%乙醇溶液定容至刻度。分別吸取該標準溶液1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0 ，5.0 mL于5個25 mL比色管中，加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min。加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min。加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，用70%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻，放置15 min，并在510 nm波長處測定其吸光度。以蘆丁濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為A=11.88C+0.0042，r=0.9999。

1.3.5 朱砂蓮總黃酮的測定

取朱砂蓮提取液0.2 mL于25mL比色管中，按1.3.4步驟測定其吸光度，并根據線性回歸方程計算提取液總黃酮的濃度，再由如下公式計算朱砂蓮總黃酮的含量。

朱砂蓮總黃酮含量(mg·g-1)=(C×VB×VT)·(VR×W)-1

式中：C為反應體系溶液的總黃酮濃度(mg·mL-1)；VB為比色管量程(25mL)；VT為提取液總體積(100 mL)；VR為反應體系中提取液體積(0.2 mL)；W為朱砂蓮質量(g)。

1.4 朱砂蓮總多酚抗氧化活性測定

1.4.1 還原能力

取0.2 mL不同濃度的提取液，并依次加入 pH值=6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1% 的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，搖勻，置于50 ℃水浴振蕩器中振蕩20 min。然后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，搖勻，取混液 2.5 mL，再加入超純水2.5 mL和 0.1%的氯化鐵溶液2.5 mL，搖勻，靜置 10 min，在 700 nm處測定其吸光度(As)，以超純水代替提取液作為空白并測定其吸光度 A0。則還原能力ΔA=As-A0，ΔA其值越大，提取液的還原能力越強[9]。

1.4.2 DPPH·清除率

在比色管中依次加入2×10-4mol·L-1DPPH·溶液2 mL 和不同濃度的提取液2mL，搖勻并置于暗室中30 min，以無水乙醇為參比液，在517 nm處測定其吸光值As，以無水乙醇溶液代替提取液作為空白并測定其吸光值A0。根據下式計算樣品溶液對DPPH·的清除率：

1.4.3 半抑制濃度IC50的計算

采用SPSS17.0計算IC50，IC50表示清除率為50%所對應的濃度，其值越小，說明清除能力越強。

1.5 數據處理

運用SPSS17.0、Origin8.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與討論

2.1 朱砂蓮總多酚的含量

按1.3.2節測定朱砂蓮提取液中總多酚含量，其值為(87.47±0.21)mg·g-1。

2.2 朱砂蓮總黃酮的含量

按1.3.3節測定朱砂蓮提取液中總黃酮含量，其值為(245.00±0.50)mg·g-1。

2.3 朱砂蓮總多酚抗氧化活性分析

2.3.1 朱砂蓮總多酚對還原能力的影響

朱砂蓮總多酚(AT)及其對照組(TBHQ)還原能力測定結果見圖1。圖1可知，還原能力隨朱砂蓮總多酚和TBHQ濃度的增加而逐漸增強，且朱砂蓮總多酚的還原能力明優于TBHQ。其次，朱砂蓮總多酚濃度與還原能力之間顯著的正相關關系也表明在朱砂蓮中的主要抗氧化活性成分為酚類物質[21]。

圖1 朱砂蓮總多酚對還原能力的影響，不同小寫字母表示差異顯著水平(α<0.05)

Fig.1 Effection of total polyphenol on total antioxidant power from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level

2.3.2 朱砂蓮總多酚(AT)對DPPH·清除能力的影響

朱砂蓮總多酚(AT)及其對照組(TBHQ)DPPH·清除能力見圖2。圖2可知，朱砂蓮總多酚的DPPH·清除能力明顯優于TBHQ。同時，朱砂蓮總多酚濃度與DPPH·清除率之間較高的正相關關系也表明在朱砂蓮中的主要抗氧化活性成分為酚類物質[11]。此外，朱砂蓮總多酚的IC50值(0.004 g·L-1)遠小于TBHQ 的IC50值(0.024 g·L-1)，也小于其他中草藥的IC50值，如：黃芪[12](IC50=0.017 g·L-1)、鐵皮石斛[13](IC50=0.395 g·L-1)、枸杞[14](IC50=0019 g·L-1)、柿葉[15](IC50=0.85 g·L-1)、地榆[16](IC50=0.691 g·L-1)、蛇莓(0.018 g·L-1)[17]、果上葉(0.022 g·L-1)[18]等。分析認為，朱砂蓮總多酚具有較強的DPPH·清除能力。

圖2 朱砂蓮總多酚對DPPH·清除能力的影響，不同小寫字母表示差異顯著水平(α<0.05)

Fig.2 Effection of total polyphenol on DPPH· scavenging rate from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level

2.4 朱砂蓮總黃酮抗氧化活性分析

2.4.1 朱砂蓮總黃酮對還原能力的影響

朱砂蓮總黃酮(AT)及其對照組(TBHQ)還原能力分析結果見圖3。圖3可知，還原能力隨朱砂蓮總黃酮和TBHQ濃度的增加而逐漸增強，但朱砂蓮總黃酮的還原能力略低于TBHQ。此外，朱砂蓮總黃酮濃度與還原能力之間較高的正相關關系也表明在朱砂蓮中的主要抗氧化活性成分為黃酮類物質。

圖3 朱砂蓮總黃酮對還原能力的影響，不同小寫字母表示差異顯著水平(α<0.05)

Fig.3 Effection of total flavonoids on total antioxidant power from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level

2.4.2 朱砂蓮總黃酮對DPPH·清除能力的影響

朱砂蓮總黃酮(AT)及其對照組(TBHQ)的DPPH·清除能力見圖4。圖4可知，朱砂蓮總黃酮的DPPH·清除能力略低于TBHQ。此外，朱砂蓮總黃酮濃度與DPPH·清除率之間較高的正相關關系，表明在朱砂蓮中的主要抗氧化活性成分為黃酮類物質。同時，朱砂蓮總黃酮的IC50值0.24 g·L-1)略大于TBHQ 的IC50值0.14 g·L-1)，但小于其他中草藥總黃酮的IC50值，如：銀杏葉[9](IC50=3.45 g·L-1)、黃芪[19](IC50=12.01 g·L-1)、藤茶[20](IC50=3.32 g·L-1)、鐵包金[20](IC50=36.41 g·L-1)、貢菊[21](IC50=0.323 g·L-1)等。分析認為，朱砂蓮總黃酮具有較強的清除DPPH·的能力。

圖4 朱砂蓮總黃酮對DPPH·清除能力的影響，不同小寫字母表示差異顯著水平(α<0.05)

Fig.4 Effection of total flavonoids on DPPH· scavenging rate from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level

3 結論

朱砂蓮總多酚和總黃酮的含量均較高，其值分別為(87.47±0.21)mg·g-1和(245.00±0.50)mg·g-1；朱砂蓮總多酚還原能力和DPPH自由基清除率高于TBHQ，但朱砂蓮總黃酮還原能力和DPPH自由基清除率小于TBHQ；朱砂蓮總多酚清除DPPH自由基的IC50值0.004 g·L-1)小于總黃酮IC50值0.24 g·L-1)；朱砂蓮總多酚與總黃酮濃度與還原能力和DPPH自由基清除率之間均呈顯著正相關關系。結果表明，朱砂蓮中抗氧化活性物質主要是酚類和黃酮類成分，且朱砂蓮總多酚和總黃酮均具有較強的自由基清除能力和還原能力，是天然的自由基清除劑和抗氧化活性劑。