超聲前處理對獲取豬皮抗氧化肽效果的影響

趙安琪，王興華，謝 偉，張 芳，王曉晴，孟 緣

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

我國是世界上較大的豬肉生產和消費國，豬肉加工生產過程中產生的大量豬皮因消化率低、加工不便、清洗不易等不利因素難以應用于衣食領域，導致資源浪費、環(huán)境污染。因此，開發(fā)利用豬皮是我國利用豬皮下腳料的主要方向之一[1]。并且豬皮膠原蛋白水解產物中含有具有生物活性的肽，其作用包括降低膽固醇[2]、抗氧化[2-3]、促創(chuàng)傷愈合[4]、降血壓[5-6]、抗菌[7]等。膠原蛋白活性肽主要通過體外消化膠原蛋白獲得，其中酶解法優(yōu)點最多，應用最廣，而文獻中報道的蛋白質酶解過程多采用堿性蛋白酶[8]，故本文所選用的單酶即為堿性蛋白酶。

然而，目前關于豬皮酶法提取的研究報道不少，但大多側重于酶解條件工藝篩選的研究，對酶解前前處理的相關研究較少，且豬皮脂肪組織發(fā)達，油脂的脫除是一大難題[9]。超聲波是頻率大于20kHZ的聲波，它是一種波動形式，同時又是一種能量形式，可用于影響、改變以至破壞媒質的狀態(tài)、性質及結構[10]，作為一種能量形式，超聲波可破壞組織細胞[11-14]，張玲[15]等研究表明，超聲能有效提高豬皮脫脂率，據(jù)此猜想超聲在豬皮酶解工藝中對其產物的抗氧化活性亦有改善，特立此題研究。

本研究以豬皮為原料，用Na2CO3對其進行脫脂后，利用單因素試驗，以ABTS自由基清除率為指標，確定酶解提取膠原蛋白抗氧化肽的最佳時間、溫度、PH和酶用量，在最佳條件下，研究超聲前處理時間對酶解產物清除ABTS自由基效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬皮：市售；堿性蛋白酶：食品級，陜西森弗天然制品有限公司，酶活力≥10萬U/g;10%鹽酸溶液、10%氫氧化鈉溶液、濃硫酸。試劑為分析純，水為高純水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

R1002旋轉蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；DV251C電子天平：OHAuS;AB135-S十萬分之一型天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司； PHS-3CPH計：上海雷磁儀器廠；PK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；電熱爐；離心機；L3S紫外分光光度計 ：上海儀電分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 脫脂

將新鮮豬皮去毛，刮除表皮脂肪，水漂洗三次，將豬皮切成5mm×5mm方形小塊，稱取一定量的剪碎的豬皮置于圓底燒瓶中，取備用豬皮四份，每份約 50g，置于旋轉蒸發(fā)瓶中，加8倍量[16]2%碳酸鈉溶液，40℃脫脂(60r/min)4h，水洗至中性，得到脫脂豬皮。

1.3.2 酶解

單因素試驗設計

參考敖冉[17]等對酶解工藝的優(yōu)選研究，將豬皮酶解單因素實驗的基本條件定為：底物濃度為6%，酶與底物濃度比2.5%，酶解pH值=8，酶解時間4h,酶解溫度50℃。改變其中一個條件，固定其他條件以分析酶與底物濃度比、酶解PH、酶解時間、酶解溫度對酶解效果的影響。各因素梯度分別為：酶與底物濃度比：2%、2.5%、3%、3.5%、4%；酶解pH：6、7、8、9、10；酶解時間：3h、3.5h、4h、4.5h、5h；酶解溫度：40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。

1.3.2.1 酶與底物濃度比因素的研究

取脫脂豬皮，用10%的氫氧化鈉調節(jié)pH值=8，在50 ℃、轉速45～50 r/min、加入堿性蛋白酶,保溫4 h的酶解條件下，考察加酶量分別為2%、2.5%、3%、3.5%、4%時酶解得到的產物對ABTS自由基的清除率。清除率結果圖 1。

1.3.2.2 酶解pH值因素的研究

取脫脂豬皮，用10%的氫氧化鈉調節(jié)pH值，在50 ℃、轉速45～50 r/min、加入堿性蛋白酶量為2.5%,保溫4 h的酶解條件下，考察酶解pH值分別為6、7、8、9、10時酶解得到的產物對ABTS自由基的清除率。清除率結果見圖2。

1.3.2.3 酶解時間因素的研究

取脫脂豬皮，用10%的氫氧化鈉調節(jié)pH值=8，在50 ℃、轉速45～50 r/min、加入堿性蛋白酶量為2.5%的酶解條件下，考察酶解時間分別為3h、3.5h、4h、4.5h、5h時酶解得到的產物對ABTS自由基的清除率。清除率結果見圖 3。

1.3.2.4 酶解溫度因素的研究

取脫脂豬皮，用10%的氫氧化鈉調節(jié)pH值=8，在轉速45～50 r/min、加入堿性蛋白酶量為2.5%,保溫4 h的酶解條件下，考察酶解溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃時酶解得到的產物對ABTS自由基的清除率。清除率結果見圖 4。

在各單因素條件下酶解后，分別取出于電熱爐上煮沸10min滅酶，冷卻，4500r的轉速離心5min，抽濾，上清液定容至250mL，取100mL于錐形瓶中，得5份待測溶液。

每個因素重復3次實驗，結果取平均值。

1.3.3 超聲前處理

對豬皮進行酶解前的超聲處理，設置處理時間分別為0min、10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min。然后在堿性蛋白酶的最適條件(酶與底物濃度比2.5%，酶解溫度50℃，pH值=8，酶解時間4h)下對超聲處理的豬皮分別進行酶解，檢測其酶解產物對ABTS自由基的清除率。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 ABTS自由基清除法原理

用 K2S2O8與 ABTS 直接生成穩(wěn)定的陽離子自由基 ABTS+，抗氧化物質與ABTS+發(fā)生反應而使反應體系褪色。

1.3.4.2 ABTS工作液的制備

ABTS儲備液(7.4 mmol/L)的制備：取ABTS 96 mg，加蒸餾水25 mL。

K2S2O8儲備液(2.6 mmol/L)的制備：取K2S2O8378.4 mg，加蒸餾水10 mL。

將5 mL 7.4 mmol/L ABTS儲備液與88 μL 2.6 mmoL/L K2S2O8混勻，靜置12～16h，配制成ABTS工作液。

1.3.4.3 PBS緩沖液的制備

稱取氯化鈉7.9g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.24g，磷酸氫二鈉1.8g，溶于800mL蒸餾水中，用HCl調節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容到1L。保存于4℃冰箱中。

1.3.4.4 ABTS+自由基清除率測定

取0.4 mL ABTS工作液，用pH值為7.4的 PBS 溶液稀釋，要求用紫外分光光度計測得其在常溫下734nm 處吸光值為 0.7±0.02。取稀釋后的ABTS+·工作液0.2 mL 與 10μL 不同條件受試物混合，常溫避光靜置 6min，在 734 nm 波長處測吸光度，平行3次。

ABTS自由基清除能力由下式計算：

清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100%

式中： A0為不加樣品，加入 ABTS 的吸光度；Ai為加入樣品和 ABTS 的吸光度。

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶酶解豬皮單因素優(yōu)化實驗結果

2.1.1 酶與底物濃度比對清除率的影響

由圖 1可知，酶與底物濃度比為2.5%時，清除率最高達88%左右，隨著酶與底物濃度比的進一步增加，清除率總體呈緩慢下降趨勢，綜合考慮清除率和經(jīng)濟因素，酶與底物濃度比以2.5%左右為宜。

圖1 堿性蛋白酶在不同酶濃度時的酶解產物對ABTS自由基的清除率

2.1.2 酶解pH值對清除率的影響

由圖2可知，堿性蛋白酶酶解豬皮存在最適pH值=8，此時清除率最高達81%左右。

圖2 堿性蛋白酶在不同酶解PH時的酶解產物對ABTS自由基的清除率

2.1.3 酶解時間對清除率的影響

由圖3可知，堿性蛋白酶在酶解時間為4h時，清除率達到最大值后開始趨于平緩，繼續(xù)加熱意義不大，此時的清除率是83%。

圖3 堿性蛋白酶在不同酶解時間時的酶解產物對ABTS自由基的清除率

2.1.4 酶解溫度對清除率的影響

由圖4可知，性蛋白酶在酶解溫度為50℃時清除率最大為82.4%，繼續(xù)升溫清除率值呈直線下降。

圖4 堿性蛋白酶在不同酶解溫度時的酶解產物對ABTS自由基的清除率

2.2 超聲預處理時間對清除率的影響

由圖5可知，超聲預處理豬皮可整體提高清除率，并且超聲50min時清除效果最好，清除率為88.9%。

圖5 堿性蛋白酶在不同超聲預處理時間時的酶解產物對ABTS自由基的清除率

3 結論

堿性蛋白酶水解豬皮的產物具有抗氧化性，堿性蛋白酶酶解豬皮的最適條件：酶與底物濃度比2.5%、酶解pH值=8、酶解時間4h、酶解溫度50℃，此時ABTS+·清除率79.8%。這與余霞[18]等、張榮華[19]等人的研究結果相一致。

超聲預處理對豬皮的酶解效果明顯優(yōu)于未超聲的效果。其中超聲時間為50min時酶解效果最好，其自由基清除率可達88.9%。