重樓內生菌多樣性及其應用研究

鹿璐

（西南林業大學 園林學院，云南昆明 650224）

植物內生菌是指生活史中的某一階段生活在植物組織內，但對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，包括那些在其生活史中的某一階段表面生的腐生菌，對宿主暫時沒有傷害的潛伏病原菌和菌根菌[1]。藥用植物內生菌的研究始于1993年，Stierle等[2]從短葉紅豆杉的韌皮部分離得到一株名為安德氏紫杉霉（Taxomyces andreanne）能產生紫杉醇的內生真菌。內生菌普遍存在于植物各部分組織中，具有豐富的多樣性。部分植物內生菌在促進宿主植物生長、生物防治及基于生物活性研究的藥物開發等方面具有經濟開發價值及生態效益。

重樓是百合科（Liliaceae）重樓屬（Paris L.）植物的統稱，藥用的主要是滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.)Hand. Mazz].和華重樓[Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.)Hara]。作為云南白藥、宮血寧等著名中成藥的主要原料，其根莖中含有的皂苷類化合物，具有抗癌、止血、消炎和免疫調節等的活性。當前，重樓的發展面臨野生資源消耗過快，人工種植種苗繁育技術難度大，生長周期長等難題。這些特性使得重樓成為當前藥用植物內生菌的研究熱點植物之一，重樓內生菌的研究對于其資源保護和開發利用具有非常重要的意義。本文將對近些年重樓植物內生菌的研究作概述。

1 重樓植物內生菌的分離、鑒定及多樣性

多年來，多位研究者采用培養法對不同地理種源的重樓植物內生菌進行分離、鑒定，對其多樣性進行了闡釋。段榮婷等[3]從云南彌勒和臨滄兩地野生滇重樓分根、莖、葉3個部位分離得到42株內生真菌。利用形態學分析及ITS序列分析進行鑒定，分離所得內生真菌歸屬于16個屬，其中彌勒滇重樓歸屬于13個屬，而臨滄滇重樓歸屬于8個屬。王茜等[4]通過對云南省嵩明縣、鶴慶縣、保山市野生滇重樓植株的根、塊莖、葉中分離，共得到內生真菌749株。基于ITS序列分析和形態學方法進行鑒定，所得菌株歸屬于41個屬，其中3個屬僅在根部出現、12個屬僅在塊莖出現、8個屬僅在葉部出現。周先治等[5]分離了華重樓健康植株和莖腐病感病植株根莖、莖、葉等不同部位的細菌，共獲得65株內生細菌。采用DNA測序技術，進行了初步鑒定。健株中的內生細菌分屬4屬11種，以芽孢桿菌為優勢菌群，根莖部菌量最高，葉部菌量較低。病株的內生細菌分屬10屬14種，以假單胞菌為優勢菌群，莖部菌量最高，葉部較低。不同植株或同個植株的不同部位內生菌多樣性不同。魏娟等[6]從人工栽培云南重樓的根莖中分離純化得到40株內生細菌，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）和腸桿菌屬（Enterobacter）分離頻率分別為35%、27.5%，是其優勢內生細菌群；野生云南重樓的根莖中分離純化得到44株內生細菌，芽孢桿菌屬（Bacillus）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）分離頻率分別為36.4%、20.4%，是其優勢內生細菌群。廖秋紅等[7]利用栽培于云南大理的滇重樓為實驗材料，對其葉、莖、根狀莖等部位的內生細菌進行了分離、純化，葉中分離純化得到18株內生細菌，莖中分離純化得到9株內生細菌，根莖中分離純化得到22株內生細菌，共49株內生細菌。通過16S RNA測序方法對其種類進行鑒定。結果顯示滇重樓葉中內生細菌含有8屬11種，莖中含有2屬5種，根莖中含有9屬11種。此外，還有多人對重樓內生菌進行分離、鑒定，詳細情況總結于表1。

表1 重樓屬植物內生菌分離、鑒定統計表

2 重樓植物內生菌的應用

2.1 抑菌活性

重樓植物內生菌的抑菌活性研究主要集中于分離所得的菌對常見作物致病菌、土傳病原菌及人類病原菌等的抑制作用。施蕊等[10]從滇重樓塊莖中分離得到98株內生真菌。采用平皿對峙培養法和發酵液萃取物制平板的方法篩選出部分對土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有抑制作用的菌株。孫靜賢等[12]對10株分離自滇重樓的內生真菌的發酵物乙醇提取物進行抗菌活性檢測，采用濾紙法以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和產氣腸桿菌為指示菌。結果發現7株對金黃色葡萄球菌有抑制作用。其中菌株YL0401發酵物乙醇提取物具有較高的抗菌活性，結合形態學特征和ITS-rDNA序列分析鑒定菌株YL0401為墻粘鞭霉（Gliomastix murorum）。宣群等[13]分別于春冬季從滇重樓植株不同部位分離得到內生真菌19株。在體外，用指示菌株金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、普通變形桿菌、痢疾桿菌、大腸埃希菌及白色念珠菌進行抑菌活性篩選，最終得到一株編號為的LRF4內生真菌菌株對白色念珠菌有較強抑制作用，形態鑒定為無孢菌群。楊正強等[14]從華重樓的地下塊莖中分離到一株內生細菌（SS02），試驗表明其發酵液對綠色木霉（Trichoderma viride）、蘆筍莖枯病菌（Phoma asparagi Sacc）、番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）、楊樹潰瘍病菌（Dothiorella gregaria）等13種作物致病菌的生長有抑制作用。形態和生理生化特征表明，SS02屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細菌。雍彬等[19]從華重樓塊莖中分離純化得到一株具有較強抑菌活性的內生細菌Iun35，經形態特征、生理生化特性及16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。將分離得到的Iun35菌株發酵培養，培養液上清經硫酸銨分級沉淀、Sephadex G-75凝膠柱層析和DEAE-32纖維素柱層析分離純化出一種抗菌蛋白UD35。用該蛋白對多種植物病原菌進行拮抗測定，結果顯示，Iun35對玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kuha）等多種菌有強烈抑制作用。程媛媛等[20]利用前期從華重樓根狀莖中分離出的一株具有較強抗菌活性的細菌PCE45。對該菌產生的抗菌肽PCP-1進行了分離純化，采用平板對峙法研究抗菌肽對真菌菌絲和孢子的影響。研究發現實驗所獲得的抗菌PCP-1熱穩定性好，且對蛋白酶K和胰蛋白酶都有較好的耐受性。抗菌肽PCP-1抑菌譜廣、活性強，對許多危害嚴重絲狀真菌、細菌都表現出很強的抗菌活性。

2.2 促生作用

內生真菌可以從宿主植物中吸收營養物質供給自身生長發育的需要，可以提高抗性，并在宿主植物的生長發育和繁殖中起重要的作用。周濃等[21]發現接種AM真菌能促進滇重樓幼苗的存活率，且不同AM真菌菌株會影響滇重樓內源激素量。楊玲玲等[22]采用的分離、篩選固氮菌的阿須貝氏（Ashby）培養基進行培養，結果得到25株陽性菌株。宋發軍等[15]利用中南民族大學生命科學學院存有的60株重樓內生細菌發酵液的水相提取液和有機相提取液對冬小麥種子萌發的影響，發現8株細菌的有機相提取物具有較明顯的促萌發作用。其中腸桿菌屬74#菌的石油醚相提取物、不動桿菌屬108#菌的氯仿相提取物、芽孢桿菌屬138#菌的氯仿相提取物和克雷白氏桿菌屬149#菌的乙酸乙酯相提取物具有較強的促萌作用。而內生菌發酵液的水相提取物均不能促進冬小麥種子的萌發，甚至存在一定的抑制作用。

2.3 生物活性

從植物體中分離的內生菌通過液體發酵培養后，檢測內生真菌體甾化合物的含量和產量，可為深入研究內生真菌甾體化合物的代謝規律奠定基礎。趙明等[8]從華重樓根莖中分離了107株菌，并通過TLC檢測菌株發酵產物篩選得到了2株可產甾體皂甙的內生菌。任智等[9]從華重樓根莖中分離了107株菌，并通過TLC檢測菌株發酵產物篩選得到了2株可產薯蕷皂甙的內生菌；16S rDNA 序列分析將其鑒定為Exiguobacterium acetylicum，與 Bacillus subtilis RZ07。歐亞娟等[16]以七葉一枝花為材料，利用HPLC檢測對七葉一枝花內生真菌產生的薯芋皂甙元的含量進行了比較，篩選出9株屬于4屬的七葉一枝花塊莖內生真菌。張曉潔等[11]從產自四川彭州的華重樓地下塊莖中分離得到16株菌。經TLC檢測篩選得到一株編號為SNUS-1（AY842149）的菌株能分泌重樓皂甙或其類似化合物。16S rDNA測序結合該菌株的形態及生理特征確定將其為托氏假單孢菌（Pseudomonas tolassii）。之后張曉潔等[23]又從野生滇重樓中分離得到16株菌。發酵培養后，發酵液分別經泡沫反應、Salkowski反應、Liberman反應及以薯蕷皂甙元為標準對照的薄層層析分析，發現編號為SNUF-1的真菌和編號為SNUA-1、SNUA-2的放線菌菌株能分泌甾體皂甙或其類似化合物。曹曉冬等人[24]從滇重樓根狀莖中分離到133株內生真菌。對其中的7株真菌進行了生物學性狀觀察但并未對其進行具體的鑒定，通過發酵培養測定了發酵液中甾化化合物的產率。

2.4 生物轉化

李忠孝等[18]結合形態學特征和ITS-rDNA序列分析確定菌株YNCA1219的分類學地位，菌株YNCA 1219鑒定為稻惡苗霉（Fusorium moniliforme Sheld.）。由HPLC圖可以看出，菌株對孕酮的轉化比較完全，得到2個轉化產物：11α-羥基孕酮和11α,15β-二氫基孕酮，可進一步做的工作。

3 問題與展望

內生真菌普遍存在于目前已研究過的各種藥用植物中。從目前已經研究過的藥用植物來看，未發現沒有分離到內生真菌的，可以推斷內生真菌在藥用植物體內普遍存在[25]。藥用植物中，青霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、木霉屬、交鏈抱屬等的出現頻率較高[26]，根據統計在重樓植物中這些屬的內生菌出現頻率也較高。但總體來說不同樣地、不同部位的重樓材料所分離得到的內生菌仍具有較大差異性，這樣豐富的多樣性可能與樣地生境以及各部位結構、成分等多種因素有關。

雖然對重樓植物內生菌的多樣性及應用等方面已經有了一定研究，但關于內生菌與重樓之間的共生機制與內生菌可產皂苷等宿主植物相似代謝產物的原理仍然有待研究。幾乎所有的植物都存在內生菌，它們與宿主植物協同進化，一同構成穩定的關系。一些理論認為宿主植物與內生菌的共生體內，一旦次生代謝中有用生化途徑出現，該途徑就能被其他生物利用，表現出相互作用和協同進化。內生菌在與宿主植物長期的協同進化中也可能通過遺傳信息的傳遞獲得宿主植物的特定代謝途徑，從而使內生真菌產生與宿主相同或相似的生理活性成分[27]。從次生代謝的角度探討重樓與內生菌之間的相互作用和協同進化關系，或可更好地了解其共生機制及內生菌可產重樓植物相似代謝產物的原理，解決重樓植物內生菌的次生代謝產物含量由于分離純化及頻繁傳代導致的含量不穩定等問題[28]。

從研究方法上來說，重樓植物內生菌的研究多數是先利用培養法來分離鑒定內生菌，但即使使用多種不同的培養基進行分離培養，仍無法將所有生活在植物組織內的內生菌全部被分離出來，有的內生菌不能離開宿主植物在人工培養基上生長，有的存在量極小難于分離，有的在嚴格的表面消毒過程被誤殺。在其他一些植物上，也有使用免培養法對植物內生菌多樣性進行研究，然而一些研究發現培養法分離鑒定得到的有些菌種在免培養法鑒定中并未獲得。因此，為更加全面地對滇重樓屬植物內生菌多樣性展開研究，未來應充分結合兩種分析方法進行使用。

總體來說，重樓植物內生菌的研究已有了不少研究成果，但目前內生菌在藥用植物領域的應用仍處于起步階段，研究多限于內生菌對宿主植物生長發育、有效成分等的研究，對其具體作用機制仍不明確，其實際應用效果也還有待研究和實踐，未來還有更多研究需要去做。