超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法測定花生中4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留

胡巧茹，叢中笑，沙美蘭，曹 鵬，梁君妮，李曉玉,關麗麗，謝 爽

(煙臺出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，山東 煙臺 264000)

花生是我國重要的糧油和經濟作物之一，我國的花生和花生油的總產量在世界上遙遙領先，并成為花生出口大國。但近年來國內花生出口形勢并不樂觀，頻頻遭遇國外利用黃曲霉毒素、農殘超標等設置的技術性壁壘，這對檢測技術的準確性和通用性提出了挑戰。

黃曲霉毒素(Aflatoxins)具有極強毒性，是對人類健康危害極為突出的一類真菌毒素，人攝入可引起致畸、致癌和致突變，是食品安全和公共衛生的一大威脅[1-2]。黃曲霉毒素主要是由黃曲霉群的黃曲霉和寄生曲霉真菌產生，主要包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2及黃曲霉毒素B1、B2在體內經過羥化衍生而成的代謝產物黃曲霉毒素M1、M2等10多種[3]。花生是最容易受黃曲霉毒素污染的農產品之一，黃曲霉對其有極高的親和性[4]，世界衛生組織及各國均加強對花生及其制品中黃曲霉毒素的檢測工作，并制訂了嚴苛的黃曲霉毒素B1及總量(包括B1、B2、G1、G2)的限量要求，因此，關注花生中黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)污染具有重要意義。此外，花生在生產、運輸過程中易受病蟲害的侵襲，需要使用多種農藥加以防治，從而導致花生中農藥殘留超標的現象頻頻出現，也造成我國出口花生遭扣留和退運情況時有發生，農藥殘留問題已成為我國花生出口的另一關鍵限制因素[5-6]。

目前，花生中的黃曲霉毒素檢測主要采用免疫親和柱凈化、酶聯免疫法、薄層色譜法、高效液相色譜法及高效液相色譜-串聯質譜法[7-8]等。花生中的農藥殘留檢測主要有凝膠滲透色譜[9-10]、基質固相分散萃取[11- 12]、QuEChERS等方法凈化，液相色譜、液相色譜-串聯質譜、氣相色譜、氣相色譜-質譜等檢測[13-14]。這些黃曲霉毒素和農藥殘留的檢測方法相對較為獨立，不能實現同時檢測；且對基質的抗干擾能力不足，易出現假陽性。因此建立花生中這兩類常見污染物的同時快速高效處理和準確定性定量檢測的方法十分必要。靜電場軌道阱高分辨質譜(Orbitrap mass spectrometry)具有高通量、高選擇性、高靈敏度等優勢，且抗基體干擾能力強，適用于多種目標化合物的篩查和確證分析。近年來，基于液相色譜-高分辨質譜聯用的分析技術越來越多應用于食品中獸藥、農藥殘留及非法添加物質的多組分測定，在食品中真菌毒素[15-16]的檢測方面也漸見研究發展趨勢。但采用高分辨質譜法同時檢測真菌毒素和農藥殘留的研究鮮見報道，謝剛等[17]采用高分辨質譜檢測玉米中的真菌毒素和農藥殘留，前處理未經凈化過程，直接提取、稀釋后進行分析；彭曉俊等[18]采用高分辨質譜測定陳皮樣品中6種真菌毒素和3種農藥殘留。但花生中這兩類污染物的同時檢測在基質干擾、目標化合物檢測范圍、提取凈化方式等方面亟需進一步研究。

本研究運用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-HRMS)測定花生中黃曲霉毒素和農藥殘留。樣品經乙腈-水-乙酸(84∶15∶1，體積比)提取、PSA與C18硅膠混合體系凈化后，正離子模式下使用含0.1%(體積分數)的甲酸水溶液和甲醇為流動相梯度洗脫，采用Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)分離，高分辨質譜定性定量檢測。該方法準確高效，重現性好，可實現對花生中4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留的同時測定，能滿足日常檢測要求且適合大批量樣品的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀Q-Exactive(ThermoFisher Scientific公司)；UltiMate 3000快速液相色譜儀(ThermoFisher Scientific公司)；3K15離心機(德國Sigma公司)；DL-5C低速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)；OA-SYS氮吹儀(美國Organomation公司)；Milli-Q超純水純化系統(美國Millipore公司)；渦旋混合器(德國IKA公司)；0.2 μm PTFE膜針頭過濾器(PALL公司)。

黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)標準溶液(濃度為0.5～2 μg/mL，Trilogy公司)；啶蟲脒、乙草胺、多菌靈、克百威、毒死蜱、苯醚甲環唑、烯酰嗎啉、吡蟲啉、嘧霉胺、戊唑醇、噻蟲嗪(農業部環境保護科學監測所，1 000 mg/L)；乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(HPLC級，美國Sigma公司)；乙酸(色譜純，天津科密歐公司)；無水硫酸鎂、無水乙酸鈉(優級純，天津科密歐公司)；PSA填料(40 μm)、C18硅膠(40 μm)購自美國Agilent公司。

1.2 樣品處理

樣品經粉碎(過20目篩)混勻后，準確稱取2.00 g樣品置于聚丙烯具塞離心管中，加入10 mL乙腈-水-乙酸提取液(84∶15∶1)，渦旋混勻1 min，加入1.0 g硫酸鎂、0.3 g無水乙酸鈉后，立即振搖1 min，4 ℃下以5 000 r/min離心5 min使固液分離。轉移上清液，并加入1.0 g硫酸鎂、100 mg PSA與400 mg C18硅膠混合體系進行分散固相萃取凈化，渦旋振蕩1 min后，于5 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于40 ℃水浴中氮吹至干，加入甲醇-水(50∶50)溶液定容至1 mL，充分混勻后，過0.22 μm濾膜，進樣分析。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。流動相：A為含0.1%(體積分數)甲酸的水溶液，B為甲醇，流速：0.35 mL/min。梯度洗脫條件：0～0.8 min，2%B；0.8～3 min，2%～24%B；3～4 min，24%B；4～6 min，24%～95%B；6～9 min，95%B；9～9.5 min，95%～2%B；9.5～12 min，2%B。

質譜條件：加熱電噴霧離子源(HESI)溫度為350 ℃；毛細管電壓為3.5 kV；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣流速為40 unit，輔助氣流速為10 unit；Full ms/dd-ms2掃描模式：采集范圍為100～600m/z，正離子采集；一級質譜分辨率為70 000 FWHM，二級質譜分辨率為17 500 FWHM；歸一化碰撞能量(NCE)為30、45、60 eV。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 提取條件的選擇本研究目標待測物為脂溶性物質，易溶于乙腈、甲醇和氯仿等有機溶劑，其中乙腈極性適中，溶解性好，可以提取黃曲霉毒素和大多數非極性和部分極性農藥殘留，并可促使蛋白質變性沉淀以提高提取效率，因此選用乙腈(或乙腈體系)作為提取劑。在參考文獻的基礎上[15]，對比了乙腈、乙腈-水(84∶16)、乙腈-水(70∶30)溶液的提取效果，發現乙腈的體積分數為84%時，提取效果最好。據文獻報道[19-20]，酸性條件可增強提取液的提取效果，對比了在提取溶劑中加入1%乙酸和不加乙酸的提取效果，結果表明，加1%乙酸后的提取效果更好，因此實驗最終選擇體積比為84∶15∶1的乙腈-水-乙酸作為提取液。

2.1.2 凈化劑的選擇HRMS的分辨率高、抗干擾能力強，能有效避免假陽性[21]，且對樣品的凈化處理要求相對較低。考慮到復雜的樣品基質會對色譜柱以及質譜檢測器等造成污染，縮短其壽命，本研究對樣品提取液進行進一步凈化處理。常用的凈化劑有乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和C18(或十八烷基硅烷鍵合相吸附劑(ODS))。其中PSA常用于去除提取液中的有機酸、脂肪酸、糖類等物質，而C18通過非極性相互作用，可以有效去除提取液中的脂類物質。使用基質匹配標準工作液制備工作曲線進行校正，對比了C18和PSA處理樣品后各目標待測物的加標回收率，結果表明C18和PSA對目標待測物均無顯著吸附，回收率相差不大，為取得更好的凈化效果，本實驗選用C18和PSA組合體系作為凈化吸附劑。

2.1.3 樣品定容溶液的選擇樣品定容溶液直接影響黃曲霉毒素和農藥殘留在色譜柱中的分離行為和離子化效率，為了選擇最佳的定容溶液，分別選取甲醇以及不同體積比(80∶20、60∶40、50∶50)甲醇-水作為樣品的定容液進行考察。實驗發現，采用純有機相定容時，部分目標待測物的響應、峰形差，而加入一定比例的水相后，目標待測物的響應增強，且峰形變好，分離度增高。當甲醇和水比例為50∶50時，各待測組分的峰形較好，因此實驗選用體積比為50∶50的甲醇-水作為定容溶液。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇對比了Thermo Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)超高效色譜柱與普通C18柱的分析效果。結果表明，Hypersil Gold C18柱的分離效果、峰形等均優于普通C18柱，因此實驗選用Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)柱進行分離。

2.2.2 流動相的優化考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液分別作為流動相，對4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留質譜響應的影響，結果顯示，相比于甲醇-水，以乙腈-水為流動相時，毒死蜱的響應明顯偏低，在HESI+電離模式下，加入甲酸可提高正離子目標物的離子化效率，從而進一步提高方法的響應值和靈敏度。因此實驗最終選取甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相，通過優化梯度洗脫程序，目標待測物得到了最佳分離。4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留混合標準溶液的提取離子流色譜圖見圖1。

圖1 4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留混合標準溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 4 aflatoxins and 11 pesticide residues mixed standard solution the extracted ion of annlyte was corresponding to the theoretical mass in Table 1

2.3 質譜條件的優化

黃曲霉毒素和農藥殘留在正離子掃描過程中均形成加氫準分子離子峰，進而在碰撞時碎裂生成子離子，其中黃曲霉毒素在負離子掃描過程中也會失去質子產生[M-H]-的分子離子，但響應值比正模式低，因此本實驗采用正離子掃描模式進行檢測。首先在分辨率(R)為70 000下對15種目標物進行一級質譜全掃描，根據目標化合物一級母離子精確質量數進行定性篩查和定量檢測。使用高分辨質譜檢測目標化合物的精確質量數對于同時準確定性和定量非常重要，因此將理論精確質量數與實際測量精確質量數的誤差控制在5×10-6范圍內，以保證質譜數據具有良好的質量準確度。當母離子強度達到設定閾值(1×106)時，自動觸發二級質譜掃描，得到的二級碎片離子信息，可結合一級母離子精確質量數和保留時間對目標化合物做進一步確證。4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留的精確質量數、質量準確度誤差及保留時間見表1。

2.4 基質效應

考慮到樣品中會存在一定的基質效應，本實驗對花生樣品中的4種黃曲霉毒素和11種農殘的基質效應進行了考察，并以目標物在空白基質液中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比來評估基質效應，當比值接近100%時，表明無明顯的基質效應，而高于100%說明有基質增強效應，低于100%則說明有基質抑制效應[16]。結果顯示，15種目標待測物的基質效應為60.1%～131.3%，表明目標檢測物在花生基質中存在一定的基質增強或抑制效應，其中AFG1的基質增強效應較強，吡蟲啉、噻蟲嗪的基質抑制效應較強。為保證方法的準確度，本實驗采用基質匹配標準溶液校正方法進行定量分析和計算。

表1 4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留的精確質量數、質量準確度誤差及保留時間Table 1 Accurate masses, mass accuracy error and retention times of 4 aflatoxins and 11 pesticide residues

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系、檢出限及定量下限采用空白的花生基質溶液，準確配制不同質量濃度的黃曲霉毒素和農藥混合標準工作液，經高分辨質譜檢測，以色譜峰面積(Y)為縱坐標，對照溶液的質量濃度(X，μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。由于高分辨質譜使用目標物的精確質量數提取，基線噪音很低，信噪比往往無窮大，因此本實驗采用向空白樣品中逐級降低加標濃度，以各目標物在線性范圍中滿足回收率在60%～120%區間內的最低濃度為方法的質量下限(LOQ)。結果表明，4種黃曲霉毒素和11種農藥在相應濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.996，定量下限為0.25～1.0 μg/kg，可滿足檢測要求。表2為4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留的線性范圍、線性方程、相關系數(r2)及定量下限。

表2 4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留的線性范圍、線性方程、相關系數(r2)及定量下限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r2) and limits of quantitation(LOQ) of 4 aflatoxins and 11 pesticide residues

2.5.2 回收率與相對標準偏差取空白花生樣品，分別添加低、中、高3個不同濃度水平的混合標準溶液，按“1.2”進行樣品前處理，每個水平重復測定6次，計算其回收率和相對標準偏差(RSD)。15種目標化合物的回收率為79.4%～120%，RSD為4.2%～10%(見表3)。方法的準確度和精密度可滿足花生中黃曲霉毒素和農藥殘留日常監測的要求。

表3 4種黃曲霉毒素和11種農藥的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD)of 4 aflatoxins and 11 pesticide residues(n=6)

2.6 實際樣品的分析

采用本文建立的方法對38份花生樣品進行分析，其中5份樣品檢出AFB1，含量為8.14～213.06 μg/kg，12份樣品檢出毒死蜱，含量為15.38～50.03 μg/kg。以一份同時檢出AFB1和毒死蜱的花生樣品為例，提取離子流色譜圖及二級質譜圖見圖2、3，并通過比較待測溶液與標準溶液的譜圖定性目標待測物。

圖2 陽性樣品中AFB1(A)和毒死蜱(B)的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of AFB1(A)and chlorpyrifos(B)in the positive sample

圖3 陽性樣品中AFB1(A)及(B)的二級質譜圖Fig.3 MS2 spectra of AFB1(A) and chlorpyrifos(B)in the positive sample

3 結 論

本研究采用UPLC-HRMS成功實現了花生中4種黃曲霉毒素和11種農藥殘留的同時快速定性和定量分析。高分辨質譜確保了復雜樣品中基質干擾的消除，顯著提高了目標物定性和定量結果的準確性。該方法快速、靈敏、準確，可滿足花生中黃曲霉毒素和農藥殘留的日常監測需求。