多壁碳納米管固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜測定茶油中12種氨基甲酸酯類農藥

張 帆，張 瑩，黃志強，白 珊，席 慧，蔡青云

(1.長沙環境保護職業技術學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省檢驗檢疫科學技術研究院，湖南 長沙 410004；3.湖南大學 化學化工學院，湖南 長沙 410082)

茶油是世界四大木本糧油之一，其富含人體必需的不飽和脂肪酸、維生素E等生物活性成分，營養保健功能極高，因此被稱為“東方橄欖油”和“油中軟黃金”[1-3]。隨著茶油消費量的逐年提升，在油茶的大量種植過程中，農藥的不當使用可能會污染環境，易使人畜發生中毒事件[4-5]。氨基甲酸酯類農藥作為殺蟲劑、殺菌劑和除草劑被廣泛應用于農作物的保護，具有高效、選擇性強、分解快、殘效期短等特點，現已廣泛用于農業生產中[6]。特別是高毒的克百威及涕滅威的濫用，會對人體產生極大危害，其降解的代謝產物半衰期長，且環境毒性比母體更強[7-8]。我國作為植物油消費大國，植物油的質量安全與人民健康和貿易增長有著密切的聯系[9]。因此，我國GB 2763-2016標準對食用植物油及油料作物中多種氨基甲酸酯類農藥殘留限量作了明確規定[10-11]。

目前關于食用油中農藥殘留檢測的研究主要側重于樣品前處理，多采用凝膠滲透色譜(GPC)凈化、商業固相萃取小柱(SPE)凈化等[12-15]傳統方法。GPC是目前針對高脂肪含量樣品的先進方法，但該儀器較為昂貴，有機試劑用量大，且處理時間較長[16];而固相萃取小柱多為一次性使用，且價格較高。多壁碳納米管(MWCNTs)作為一種高效、廉價的固相萃取吸附劑，憑借其較強的表面吸附作用被越來越多地應用于樣品的富集和凈化[17-21]。目前，MWCNTs固相萃取小柱用于茶油中氨基甲酸酯類農藥的研究尚未見報道。本研究將MWCNTs固相萃取小柱用于茶油樣品凈化，能夠有效降低茶油中脂肪等大分子雜質的干擾，該小柱經甲苯溶液處理后，可重復利用，并采用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)進行測定，建立了一種高效、準確、簡便的茶油中12種氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測方法。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

1.2 儀器設備

LCMS-8040超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀，配ESI源(日本島津公司)；XS20電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；SA300振蕩器(日本大和科學株式會社)； SB-5200DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Universal320 高速冷凍離心機(德國海蒂詩公司)；固相萃取裝置(上海安譜科學儀器有限公司)；RE600旋轉蒸發儀(日本Yamato公司)；Milli-Q去離子水系統(美國密理博公司)。

1.3 MWCNTs SPE柱的制備

準確稱取75 mg MWCNTs填料置于6 mL塑料固相萃取空柱管中，用篩板固定填料，使固相萃取小柱中填料的裝填高度保持在0.3 cm左右。

1.4 混合標準工作溶液的配制

分別稱取12種農藥標準品10.00 mg(精確至0.000 1 g)于12個10 mL容量瓶中，加少量乙腈振蕩溶解后，以乙腈定容，配制成1.0 mg/mL的12種農藥單標儲備液，儲存于4 ℃冰箱。以0.1%乙酸-乙腈(5∶5，體積比)進行逐級稀釋，配制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 μg/mL的12種農藥混合標準工作溶液，現用現配。

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品的提取準確稱取茶油樣品2.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞聚四氟乙烯離心管中，向離心管中加入10 mL乙腈，置于振蕩器上充分振蕩混勻5 min，超聲提取10 min，將離心管置于-20 ℃冷凍離心機中，以8 000 r/min冷凍離心10 min后，將上清液轉移至另一離心管中，下層殘渣再用10 mL乙腈提取1次，冷凍離心10 min，合并兩次上清液，混勻后取10 mL至旋轉蒸發瓶中，于旋轉蒸發儀上40 ℃濃縮至約2 mL，待凈化。

1.5.2 固相萃取凈化在MWCNTs 固相萃取小柱上端裝入1 cm高的無水硫酸鈉，先用6 mL乙腈預淋洗小柱，棄去淋洗液。將待凈化的茶油提取液完全轉移至萃取小柱中，用15 mL離心管收集流出液，直至提取液完全通過該柱。用8 mL乙腈進行洗脫，控制流速為0.5 mL/min，收集所有流出液。然后在旋轉蒸發儀上40 ℃濃縮至近干，用0.1%乙酸-乙腈(5∶5)定容至1.0 mL，過0.45 μm有機濾膜后，待測定。

1.6 UPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱:Shim-pack XR-ODSⅢ柱(2.0 mm×50 mm，1.6 μm)。流動相：A為0.1%乙酸，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～5 min，10%～40%B；5～10 min，40%～85%B；10～10.5 min，85%～10%B；10.5～14 min,10%B；流速：0.4 mL/min。柱溫：40 ℃；進樣量：5.0 μL。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描；掃描方式：多反應監測(MRM)；駐留時間：100 s；離子源接口電壓：3.5 kV；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；霧化氣：氮氣，流速3.0 mL/min；干燥氣：氮氣，流速15 mL/min；碰撞氣：氬氣，純度99.999%；其他質譜參數見表1。

表1 12種氨基甲酸酯農藥的MRM質譜分析參數Table 1 MS parameters for multiple reaction monitoring of 12 carbamate pesticides

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 提取方式的選擇

比較了振蕩提取和超聲提取兩種方法對茶油中12種農藥的回收率。準確稱取4份空白茶油樣品各2.0 g，分別添加0.02 mL 5 μg/mL的12種農藥混合標準溶液，按照“1.5”進行樣品前處理，其中振蕩提取法提取時間為15 min，超聲提取法提取時間為 10 min，超聲功率為180 W，每種方法平行2次。結果顯示，超聲提取法對茶油中12種農藥的提取回收率略高于振蕩提取法，這主要是由于超聲波對樣品的滲透力更強，提取效率更高。故實驗最終選擇超聲提取法。

2.2 凈化材料的選擇

比較了分別填裝70 mg 氧化石墨烯(GO)、MWCNTs固相萃取小柱和商業C18固相萃取小柱對茶油中12種農藥的吸附凈化效果，在6支50 mL試管中各加入2.0 g空白茶油樣品，并按0.05 μg/g 加入混合標準溶液，按照“1.5”處理后采用本方法測定，平行2次。如圖1所示，GO小柱對12種農藥的吸附性很強，其中滅害威、抗蚜威基本無回收，涕滅威的回收率很低。MWCNTs小柱和C18小柱的回收率均較理想，但C18小柱的凈化效果略差，譜圖中有很多雜峰，而MWCNTs小柱經甲苯溶液處理后可重復利用，所以實驗選擇MWCNTs作為凈化材料。

圖1 不同固相萃取小柱對12種氨基甲酸酯農藥回收率的影響Fig.1 Effect of different SPE columns on recoveries of 12 carbamate pesticides

2.3 多壁碳納米管的選擇

考察了4種不同類型MWCNTs的凈化能力，分別取70 mg MWCNT-1、MWCNT-2、MWCNT-3、MWCNT-4填充成固相萃取小柱，對加標量為0.05 μg/g的空白茶油樣品按照“1.5”進行實驗，取兩次測定結果的平均值。結果表明，MWCNT-1由于其較大的比表面積和較強的吸附性等特點，對茶油樣品的凈化能力最強，12種農藥均獲得較滿意的回收率。因此，選擇MWCNT-1為固相萃取的吸附劑。進一步比較了多壁碳納米管的用量(25、50、75、100 mg)對回收率的影響，綜合考慮12種氨基甲酸酯類農藥的整體回收率，實驗選擇MWCNT-1用量為75 mg。

2.4 洗脫溶劑體積的選擇

比較了洗脫溶劑乙腈的體積(2、4、6、8、10 mL)對添加0.01 mL 5 μg/mL混合標準溶液的多壁碳納米管固相萃取小柱的洗脫效果。結果表明，隨著乙腈體積的增加，12種待測目標物的回收率逐漸增大，當乙腈體積大于6 mL時，絕大部分待測目標物的回收率達到最大并保持穩定。為保證所有目標物均被洗脫下來，實驗最終選擇洗脫溶劑乙腈的用量為8 mL。

圖2 12種氨基甲酸酯類農藥混合標準溶液(0.1 mg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram of 12 carbamate pesticides standard solution(0.1 mg/L) the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.5 色譜條件的優化

比較了Shim-pack XR-ODS柱(3.0 mm×100 mm，2.2 μm)和 Shim-pack XR-ODSⅢ柱(2.0 mm×50 mm，1.6 μm)兩種不同規格色譜柱的分離效果和載樣能力。結果顯示，Shim-pack XR-ODSⅢ柱由于填料粒徑小，耐受壓力高，可在8 min內完成12種待測農藥的有效分離，與Shim-pack XR-ODS柱相比大大縮短了樣品分析時間。因此實驗選擇Shim-pack XR-ODSⅢ柱(2.0 mm×50 mm，1.6 μm)，并對流動相的梯度洗脫程序進行優化。在“1.6”條件下，12種待測農藥混合標準溶液(0.1 mg/L)的總離子流色譜圖見圖2。

2.6 線性范圍與定量下限

按照“1.4”配制系列質量濃度的混合標準工作溶液，采用本方法進行測定，以質量濃度為橫坐標，12種待測農藥的響應峰面積為縱坐標進行線性回歸。通過陰性茶油樣品加標來確定12種農藥的定量下限(LOQ)。由表2可知，12種待測農藥均在0.005～0.1 μg/mL范圍內線性良好，相關系數(r)均不小于0.998 88，LOQ為0.2～3.0 μg/kg。

2.7 加標回收率與相對標準偏差

在陰性茶油樣品中添加一定量的混合標準工作溶液，使得各茶油樣品中12種待測農藥的含量分別為0.01、0.025、0.05 mg/kg，每個加標水平做6個平行樣品，按照本方法進行測定。由表2可知，在3個加標水平下12種農藥的回收率為78.3%～116%，相對標準偏差(RSD)為 2.6%～12%，表明本方法的準確度和精密度可滿足茶油中上述農藥殘留的檢測要求。

表2 12種氨基甲酸酯類農藥的線性方程、相關系數(r)、定量下限、加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r),limits of quantitation(LOQs),recoveries and relative standard deviations of 12 carbamate pesticides(n=6)

2.8 實際樣品的測定

采用本方法對隨機選購的市售30 個茶油樣品進行篩查，其中2 個茶油樣品中檢出克百威，殘留量未達到本方法的定量下限，其余28個樣品均未檢出上述12種農藥殘留。

3 結 論

本研究將填充的多壁碳納米管小柱用于茶油的前處理凈化，并結合UPLC-MS/MS分析，建立了一種快速、準確測定茶油中12種氨基甲酸酯類農藥殘留的分析方法。實驗結果表明，MWCNTs 固相萃取小柱凈化效果良好，有效降低了茶油中油脂等大分子的干擾，且可重復使用，大大降低了分析成本。12種待測農藥的LOQ為0.2～3.0 μg/kg，回收率為78.3%～116%，RSD為 2.6%～12%。該方法操作簡便、選擇性好、準確度高,可作為茶油中多種氨基甲酸酯類農藥殘留的測定方法。