柱前衍生毛細管電泳-電致化學發光法測定瓜瓤組織中的瓜氨酸含量

楊 寧,周 敏,王 榮,劉 芬,王蘇霞,馬永鈞

(西北師范大學 化學化工學院 甘肅省生物電化學與環境分析重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

瓜氨酸是一種最先從西瓜汁中發現的非蛋白類氨基酸,在一些葫蘆科植物生物組織中的含量較為豐富。西瓜、甜瓜、籽瓜和哈密瓜都是我國重要的經濟類作物，尤其紅瓤西瓜組織內含有多種維生素、微量元素、番茄素和瓜氨酸[1-2],人們通過鮮食瓜瓤組織即可直接攝取這些營養物質從而獲得保健作用[3-4]。從人體生理學角度看，瓜氨酸是人體中參與尿素代謝的一個重要中間物,適度攝入瓜氨酸可以增強人體的免疫力，促進血液循環，保護心血管；瓜氨酸還可以作為一種有效化學成分用于生產保健食品和護膚、去斑美容化妝品[5-6]。此外，瓜氨酸在一些疾病的防治方面也扮演著重要角色，可用于阿爾茲海默綜合癥和由暫發性腦血管缺血導致的失憶癥的輔助治療，對罹患高血壓絕經婦女的主動脈硬化和肌肉機能改善也有良好的功效[7-8]。

瓜氨酸又稱為氨基甲酰鳥氨酸[5]，其分子結構式見圖1。目前，瓜氨酸的分析方法主要有高效液相色譜法[9-10]、生物酶法[11]、氣相色譜-質譜聯用法[12]、熒光猝滅法[13]、間接核磁共振法[14]等。這些方法中，將瓜氨酸化學衍生化后再進行分析的方式非常普遍[9-10,12-13]，樣品預處理環節也相對較復雜，儀器成本高。因而簡化衍生反應，盡量減少樣品預處理過程中的繁瑣操作，并降低整個分析過程的時間成本和儀器使用成本都是開發新方法必須考慮的因素。近年來，毛細管電泳法因具有分離效率高、分析速度快、進樣量小以及分析成本低等優勢，在復雜生物樣品中氨基酸類化合物的定量分析方面得到了廣泛應用[15-17]。

圖1 瓜氨酸的化學結構式Fig.1 Chemical structure of citrulline molecule

另一方面，電致化學發光法(ECL)具有高靈敏度、高選擇性和高信噪比響應等優勢，毛細管電泳-電致化學發光聯用分析法(CE-ECL)也得到了長足的發展[18-19]。眾所周知，二氯三聯吡啶合釕(Ru(bpy)3Cl2)及其衍生物是一類重要的電致化學發光探針試劑[20-22]，可與胺類共發光物產生特殊的共發光效應，且胺類化合物的ECL強度按叔胺﹥仲胺﹥伯胺有依次下降的趨勢[23-24]?；谠撛?，本文參照此前的文獻[25-26]對柱前衍生氨基酸的方法做了改進，以甲醛和硼氫化鈉為主要衍生試劑，將瓜氨酸分子中與α-碳原子相連的伯氨基進行徹底N-甲基化形成叔胺基團，從而極大地增加了電致化學發光法檢測瓜氨酸的靈敏度，據此建立了一種柱前衍生CE-ECL法測定瓜瓤組織中瓜氨酸含量的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型多參數分析測試系統(西安瑞邁電子科技有限公司)；CHI 760B電化學工作站(上海辰華儀器公司)；熔融石英毛細管(47.5 cm×75.0 μm i.d.河北永年光導纖維廠)；pH-10型酸度計(德國賽多利斯)；化學發光檢測采用三電極系統：工作電極采用參照文獻制備[27]的含稀土類普魯士藍(Er-PBAs)修飾的鉑盤電極(Φ=0.3 mm)，輔助電極為鉑絲，參比電極為Ag/AgCl(1.0 mol/L KCl)電極。

L-瓜氨酸(含量>99.0%)、二氯三聯吡啶釕(Ru(bpy)3Cl2·6H2O,含量>99.95%)和殼聚糖(脫乙酰度>95%)均購自百靈威科技有限公司；甲基-β-環糊精、環己烯二酸(含量>98%)(上海阿拉丁試劑有限公司)；順丁烯二酸(含量>98%，山東西亞化學工業有限公司)。其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水(>18 MΩ·cm)。

1.2 電泳測定條件

分析毛細管采用殼聚糖做內壁修飾處理劑[28]。將0.25 mol/L的氫氧化鈉打入新毛細管內處理0.5 h后，以清水沖洗；再將含有12.0 mmol/L 十二烷基硫酸鈉+10.0 mmol/L的硼酸+10.0 mmol/L的醋酸鈉+4.0 mmol/L環己烯二酸+1.1 mmol/L戊二醛的混合溶液打入毛細管內，放置50 min后用氬氣排空；再打入含10.0 mg/mL殼聚糖的稀冰醋酸溶液(1%,體積分數)靜置1 h，用氬氣排空后立即在65 ℃烘箱中加熱90 min；最后用1.0 mol/L甲醛溶液和0.01 mol/L氫氧化鈉溶液依次打入毛細管內并各停留數十秒后排空，再置于烘箱中以65 ℃熱處理10 min，取出冷卻至室溫，備用。

1.3 標準溶液與試樣溶液的制備與衍生步驟

配制含250 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 5.95)以及含有10%甲醇的2.00 mmol/LL-瓜氨基酸標準溶液并置于4 ℃冰箱中保存，備用。

分別稱取1.000 0 g 去籽并搗碎的西瓜、甜瓜、籽瓜、哈密瓜的鮮瓜瓤樣品于100 mL小燒杯中，各加入20.00 mL含有10%甲醇的蒸餾水，置于超聲波器中振蕩提取10 min，攪勻后靜置片刻，取上層清液備用。

在10 mL比色管中先加入1.00 mL 250 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 5.95),用移液管準確加入一定體積的瓜瓤組織浸取液或L-瓜氨酸標準溶液(要求樣品的總體積< 2.0 mL)，再加入0.80 mL 0.5 mol/L的甲醛溶液并用超純水稀釋至5.0 mL后于常溫下反應60 min；此后，在該比色管中連續加入0.40 mL 0.2 mol/L的氫氧化鈉、0.60 mL 0.01 mol/L的順丁烯二酸和0.16 mL 0.1 mol/L的咪唑溶液，搖勻后置于 57 ℃恒溫水浴中加熱反應50 min；最后，向該比色管中依次加入0.25 mL 0.1 mol/L醋酸銨、1.00 mL 0.25 mol/L硼氫化鈉(使用時臨時配制)以及0.50 mL 0.2 mol/L的硼酸。這3種試劑的加入反應時間間隔依次保持為10、20、10 min。最后稀釋至10.0 mL，取此溶液適量，經濾膜過濾后進樣測定，也可于冰箱中保存，在2周內進行測定。

2 結果與討論

2.1 L-瓜氨酸衍生產物的電致化學發光響應特征

對比L-瓜氨酸標準物及其衍生產物的CE-ECL電泳圖，結果顯示，未經衍生的L-瓜氨酸進樣后幾乎看不到任何明顯的發光信號峰，而經衍生后，L-瓜氨酸樣品出現了兩個明顯的電泳信號峰(圖2)。通過加標驗證實驗，確定1號峰源于反應剩余甲醛的發光衍生物，而2號峰源于L-瓜氨酸衍生產物中唯一具有發光活性的組分。對比曲線a和b在峰2處的強度可知，L-瓜氨酸衍生物相比未衍生L-瓜氨酸的發光強度至少增敏了200多倍，且無其它雜質峰出現。由圖1結構式可知，瓜氨酸是具有α-伯胺基的氨基酸，衍生反應將瓜氨酸分子中與α-C相連的氨基徹底N-甲基化形成含α-叔胺基的分子結構，得到ECL發光信號更強的衍生物結構，且瓜氨酸在柱前衍生反應中會發生消旋化現象[29],因此含叔胺基的衍生產物的ECL發光信號強度值將不會受到被測樣品中瓜氨酸分子旋光性的影響。由此可知，通過控制柱前衍生反應條件可使L-瓜氨酸或D-瓜氨酸都轉化成發光產物，得到峰形對稱的單一的CE-ECL電泳峰，進而可實現對瓜氨酸總量的高選擇性定量測定。

圖2 L-瓜氨酸純品(a)和L-瓜氨酸衍生物(b)的電泳圖Fig.2 Electropherograms of L-citrulline(a) and its derivative product(b)ECL peak 1 and 2 are attributed to the derivative product from formaldehyde and L-citrulline,respectively

2.2 柱前衍生反應條件的優化

按照對α-伯胺基進行柱前N-甲基化衍生反應的有機反應途徑[25-26]，將瓜氨酸轉化為含α-叔胺基的衍生產物主要分3個步驟：首先，在室溫下與甲醛反應1 h使α-伯胺基通過親核加成形成氨基醇中間體；其次，通過加入NaOH將體系的pH值調至7.5左右，使氨基醇中間體在57 ℃的恒溫水浴中脫水形成亞胺中間體；第3步是將亞胺中間體再用硼氫化鈉化學還原成氨基酸的N-甲基化衍生產物。實驗過程中發現，體系的pH值和脫水溫度對瓜氨酸衍生物的ECL峰高和峰形都有較大的影響。因此，本研究以100 μmol/L的L-瓜氨酸標準樣進行柱前衍生反應制備測試樣，再根據其CE-ECL電泳圖的峰強度值對NaOH的加入量和衍生反應溫度進行優化。

2.2.1 氫氧化鈉加入量的優化實驗發現，當加入的NaOH為0.08 mmol時，L-瓜氨酸衍生物的CE-ECL峰強度最大，此時體系的pH值為7.5，L-瓜氨酸衍生物電泳峰的峰形對稱，半峰寬值最小。而當NaOH加入量大于0.08 mmol時，電泳峰強度下降且L-瓜氨酸衍生物的電泳峰出現分叉、峰形展寬的現象。因此選擇加入0.08 mmol 的NaOH。

2.2.2 衍生反應溫度的優化在整個衍生反應過程中，適當的脫水溫度有利于亞胺中間體的生成，且不會過多產生其它的副反應中間體。實驗結果顯示，當衍生反應溫度控制在57 ℃左右時，L-瓜氨酸衍生物的電泳峰峰強度達到最大；而繼續升高反應溫度時，其發光強度有所減小。更重要的是，若以過高的溫度進行L-瓜氨酸衍生反應，會出現多個具有不同遷移時間的新發光信號峰，即有多個發光的副產物形成，進而將造成被測試樣中L-瓜氨酸初始濃度值與其衍生產物ECL強度值之間的線性響應關系發生偏離。由此，確定最佳的衍生反應溫度為57 ℃。

2.2.3 電泳分離添加劑的優化由于瓜瓤組織的化學成分比較復雜，有其它氨基酸類物質存在，為保證瓜氨酸衍生產物的電泳峰不受共存雜質的干擾，本實驗采用殼聚糖內壁修飾毛細管為分離毛細管，并在分離運行液中添加多種分離添加劑，以保證瓜氨酸的衍生峰與相鄰雜質峰能達到基線分離。圖3的內插圖是實際籽瓜樣品的柱前衍生CE-ECL電泳圖，可見該籽瓜樣品中瓜氨酸衍生物電泳峰的峰形尖銳、峰高明顯、出峰時間適宜，且與其它成分電泳峰之間的分離效果良好。以此實際樣品為測試物，對實際運行液中各添加組分的最佳濃度值進行優化。最終選取32.0 mmol/L硼砂緩沖溶液(pH 8.0)為基本緩沖溶液，再添加5.0 mmol/L的SDBS、9.0 mmol/L的STPP、3.5 mmol/L的β-甲基-環糊精和4 %的甲醇組成分離運行緩沖溶液。需要注意的是，由于運行緩沖溶液中SDBS的加入量對待測物發光強度和分離度影響較大，須精確控制其加入量至5.0 mmol/L。

2.2.4 柱前衍生電致化學發光法測定瓜氨酸的分析性能在上述優化實驗條件下，用不同濃度的L-瓜氨酸標準溶液進行柱前衍生，再分別紀錄其CE-ECL電泳圖。實驗結果表明：當瓜氨酸反應初始濃度為9.0～250 μmol/L時，其衍生物的電泳峰強度值與濃度之間呈現良好的線性關系,線性回歸方程為IECL=-42.3+29.9ccitrulline(r2=0.999 6)，計算得檢出限為3.2 μmol/L(S/N=3)。該結果明顯優于采用毛細管電泳-紫外吸收光譜聯用檢測法(CE-UV-Vis)的靈敏度[15]。此外，對含100 μmol/LL-瓜氨酸的衍生標樣平行進樣6次，測得其電泳峰強度值和遷移時間值的相對標準偏差分別為2.6%和0.92%，表明本法的精密度良好。

圖3 用標準加入法測定實際瓜瓤樣品的CE-ECL電泳圖Fig.3 Electropherograms of a real melon sample by using the standard addition method spiked L-citrulline(a-e):0.0，40，80，120，160 μmol/L

2.3 實際樣品測定

實際籽瓜樣品的加標實驗結果如圖3所示。在籽瓜瓜瓤樣品中加入不同量的L-瓜氨酸標準溶液并進行柱前衍生后，分別紀錄其CE-ECL電泳圖，僅發現2號峰位置處各加標樣的電泳峰強度值隨著加標量的增加而逐漸增大，且此電泳峰的遷移時間和峰形均基本保持穩定，無其他干擾峰或雜質峰出現。

采用標準加入法對一組樣品如西瓜、籽瓜、甜瓜、哈密瓜4種瓜瓤組織中的瓜氨酸分別進行定量測定，并將測得值按瓜瓤組織鮮重為計量單位進行換算，結果見表1。可知上述幾種瓜瓤組織中瓜氨酸含量略有不同，其中西瓜瓤中瓜氨酸含量為最高，鮮重含量達到2.75 mg/g，與文獻報道值完全符合[12]。另取一組實際樣品進行加標回收實驗，得其加標回收率為91.4%～106%。表明用本法測定瓜氨酸的精密度和回收率均令人滿意。

表1 幾種實際樣品中瓜氨酸含量的測定結果Table 1 Determination results of citrulline content in the several real samples

3 結 論

本文基于N-甲基化衍生反應可將瓜氨酸分子中的α-伯氨基成功轉化為α-叔氨基，從而極大增加其電致化學發光檢測靈敏度的分析原理，利用殼聚糖內壁修飾毛細管為分離毛細管并輔以分離添加劑，成功建立了柱前衍生毛細管電泳-電致化學發光法測定瓜氨酸含量的通用性分析方法。實驗證明：此衍生方法簡單、易操作，衍生產物單一、穩定，經過衍生的瓜氨酸的ECL強度能提高200余倍。同時，該測定方法還具有選擇性好、靈敏度高、衍生試劑價格低廉等優點，完全適用于不同種類瓜瓤組織中瓜氨酸含量的分析。