紙芯片顯色法用于L-半胱氨酸的快速測定

張 劍，謝婷婷，楊玉瑩，劉春葉*，Frank A.GOMEZ，Wilson LEE，肖 倩

(1.西安醫學院 藥學院,陜西 西安 710021；2.加州州立大學 化學與生物化學系, 美國 洛杉磯 90001)

紙芯片是近年來備受關注的一種具有廣闊應用前景的新型微流控分析器件，是基于紙質材料(如濾紙、色譜紙、硝化纖維膜等)制成的微流控芯片[1-2]，其不僅保留了傳統微流控芯片的微型化、自動化和集成化的優點，還結合了紙質材料本身所具有的成本低廉、制作簡便、可循環再生和生物相容性好等特性。目前，紙芯片已被廣泛應用于醫藥衛生[3-5]、食品安全[6-8]、環境監測[9-11]等領域的實時現場檢測，對貧困國家和偏遠地區的個性化醫療和診斷的普及具有一定推動作用。

含巰基類化合物如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hys)、谷胱甘肽(GSH)、膽堿等在生物體內扮演著重要的角色，如人體液中Cys的含量大幅波動會導致帕金森、老年癡呆、嗜睡、水腫等疾病。因此，實時準確、快速、高選擇性地檢測血樣中巰基化合物的含量，對于生物化學研究及臨床診斷具有十分重要的意義[12-13]。目前，含巰基化合物的常用儀器檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)[14]、紫外分光光度(UV)法[15-18]、熒光分光光度法[19]、電化學法[20]、原子吸收光譜法[21]、氨基酸分析儀[22]等，其中HPLC需對樣品進行柱前或柱后衍生，且衍生步驟較為繁瑣；電化學法雖不需衍生，但因Cys具有不可逆氧化性質，在檢測過程中易導致電極老化，且重現性差?；诩埿酒臋z測方法有比色法[19,23]、熒光法[24]、化學發光法[25]、表面增強拉曼法[26]、電化學檢測[27]等，比色法因無需輔助檢測設備，是目前紙芯片分析中最為直觀方便、簡單快速的檢測方法。本研究以5,5'-二硫硝基苯甲酸(DTNB)作為顯色劑，優化顯色反應條件，建立了一種基于紙芯片的顯色法用于L-Cys的快速測定，并將其用于實際血清樣品的檢測，以探究含巰基類化合物的現場快速測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ALC-210.4電子天平、PB-10 pH計(北京賽多利斯科技儀器有限公司)；UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計(上海尤尼克儀器有限公司)；TDL-40B離心機(上海安亭科學儀器廠)；魅族MX4手機(800萬像素，魅族科技有限公司)；1號定性濾紙(英國Whatman公司)。

L-半胱氨酸(L-Cys)、DTNB(純度≥99.0%，北京索萊寶科技有限公司)；L-色氨酸(純度≥99.0%，天津市科密歐化學試劑有限公司)；L-組氨酸(純度≥99.0%，上海藍季科技發展有限公司)；L-丙氨酸(98.5%，天津市博迪化工有限公司)；D-苯丙氨酸、DL-谷氨酸(98.0%，上海晶純生化科技股份有限公司)；牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O(純度≥99.0%，成都市科龍化工試劑廠)；碳酸氫鈉(純度≥99.0%，天津市永大化學試劑有限公司)；淀粉(分析純，天津市風船化學試劑有限公司)；葡萄糖、氯化鉀、氯化鈉、氯化銨(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；硫酸鈉、硫酸鋅、無水氯化鈣(天津市河東區紅巖試劑廠)；實驗用水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.2 實驗方法

圖1 檢測L-半胱氨酸的紙芯片結構Fig.1 Paper chip structure for detecting L-Cys

圖2 L-半胱氨酸的檢測原理Fig.2 Detection principle of L-Cys

1.2.1 紙芯片的制作采用Inkscape 0.91軟件設計紙芯片結構圖案(見圖1)，其中A為Cys樣品加載區，B為流體通道，C為顯色區域，D為顯色劑DTNB加載區，灰色邊緣是疏水圍堰，周圍為親水區域。A、C、D區域直徑分別為4、4、6 mm，B通道長7 mm，寬2 mm。設計顯色區域C可較好地解決干燥過程中的顏色貼壁現象。將設計好的結構圖案用Xerox Phaser 8400噴蠟打印機打印在Whatman 1號定性濾紙上，然后于176.7 ℃下熱壓2 min，使濾紙表面粘附的蠟加熱融化后滲入濾紙內部，形成親水與疏水相間的通道網絡，取出后于室溫下冷卻。

1.2.2 紙芯片檢測原理用磷酸鹽緩沖溶液配制DTNB，在中性或偏堿性條件下，DTNB與Cys的巰基發生交換反應，生成黃色的2-硝基-5-硫代苯甲酸陰離子(TNBA)(圖2)，其顏色強度和L-Cys的含量成正比。將6.0 μL待測L-Cys樣品滴加于A區域，再加入6.0 μL DTNB標準溶液至D區，2種溶液在毛細作用下相向移動至顯色區C，相遇發生反應并顯色，然后用手機拍照，記錄實驗數據。拍照時將紙芯片置于臺燈下方，由于使用手機軟件CS掃描全能王進行掃描，每次僅需拖動邊框確定掃描區域，即可獲得和掃描儀類似效果，故拍照距離對測定結果無影響。然后利用Photoshop CC軟件對數據進行處理，在顯色區C區選擇5個相同大小的區域，分別讀取RGB通道(即紅、綠、藍三疊加通道)的顯示圖像亮度的平均值，進行比色檢測。

1.2.3 紫外分光光度法(UV)取0.5 mLL-Cys溶液加入0.5 mL 4.0 mg/mL DTNB標準溶液中，搖勻，室溫反應10 min，于波長412 nm處測定其紫外吸光度值。

2 結果與討論

2.1 顯色條件的優化

2.1.1 上樣量的影響同等條件下，為增加顯色強度，理論上應加載較多的反應試劑，但由于芯片尺寸限制，加載量不能過大。故本研究考察了上樣量(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 μL)對顯色效果的影響(圖3)。由圖3可見，當上樣量為6.0 μL時，紙芯片測定區填充效果和顯色強度均達到最佳狀態，因此本實驗選擇6.0 μL為最佳上樣量。

圖3 上樣量對顯色強度的影響Fig.3 Effects of loading amount on color intensity

2.1.2 緩沖液pH值的影響DTNB在偏酸性溶液中較為穩定，反應產物在偏堿性條件下易離子化顯色，因此需考察緩沖液pH值對測定結果的影響。固定其他實驗條件，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制DTNB顯色液及L-Cys標準溶液，考察了不同pH值(6.0、7.0、7.4、8.0、9.0)對顯色強度的影響。結果表明，當pH值為7.4時體系顯色強度最大，故選擇pH 7.4的PBS緩沖液來進行溶液的配制。

2.1.3 顯色時間的影響由于化學反應進度與時間相關，且在反應過程中紙芯片上溶液的不斷蒸發也會對顯色強度產生一定影響，故需考察顯色時間對分析結果的影響。固定其他實驗條件，每隔1 min拍照，考察顯色時間(1～10 min)對結果的影響(圖4)。由圖可見，檢測區的顯色強度在3～6 min時間內比較穩定，并在4 min時最大，之后隨著顯色時間延長逐漸減小。因此，最終確定較優顯色時間為4 min。

圖4 顯色時間對顯色強度的影響Fig.4 Effects of coloration time on color intensity

圖5 半胱氨酸檢測的選擇性Fig.5 Selectivity of L-Cys detection

2.2 選擇性考察

本實驗采用L-色氨酸(L-Trp)、L-組氨酸(L-His)、L-丙氨酸(L-Ala)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、DL-谷氨酸(DL-Glu) 5種氨基酸對該方法的選擇性進行考察(圖5)，結果顯示，在相同條件下，L-Cys的顯色強度遠高于其他氨基酸，表明該檢測體系具有良好的選擇性。

2.3 干擾實驗

2.4 L-Cys標準曲線與檢出限

在最優條件下，制備L-Cys工作曲線并計算檢出限。結果表明，在0.01～0.1 mmol/L范圍內，顯色強度(y)與L-Cys濃度(x)之間呈良好的線性關系，線性方程為y=297.944 2x+106.607，r=0.999 8，計算得檢出限(高于空白對照RGB值10)為0.001 mmol/L。

2.5 加標回收率及重復性考察

為了考察方法可靠性，取供試品溶液進行加標回收率實驗(表1)，得方法的加標回收率為98.1%～102%。取0.14 mmol/LL-Cys標準溶液進行重復性實驗。結果顯示，日內相對標準偏差(RSD,n=5)為0.6%，日間RSD(n=5)為1.2%，表明本方法重復性好。

表1 加樣回收實驗Table 1 Plus sample recovery test

2.6 與UV結果的比較

取空白牛血清0.1 mL置于離心管中，加入0.2 mL乙腈，振搖，于10 000 r/min 轉速下離心10 min，取上層清液，N2吹干，再用純凈水稀釋至1 mL即得血清樣品溶液。將該血清樣品溶液分別采用UV方法(實驗條件見“1.2.3”，借鑒了Ellman方法)和本研究建立的紙芯片法測定其中的L-Cys。結果顯示，UV法未檢出，而紙芯片法檢出濃度為0.013 mmol/L。再向血清樣品中加入不同量的L-Cys標準品，測得其加標回收率為99.1%～103%(表2)。結果顯示，紙芯片方法與傳統UV法偏差較小(-0.4%～-0.9%)，結果可靠，表明本研究建立的紙芯片法可應用于實際血清樣品的檢測。

表2 血清樣本中L-Cys的測定Table 2 Detection of L-Cys in serum samples

3 結 論

本研究以Whatman 1號定性濾紙作為紙芯片制作材料，選用DTNB作為顯色劑，成功構建了一種基于紙芯片快速檢測L-Cys的新方法。通過手機拍照采用Photoshop軟件分析顯色強度，從而進行比色檢測。該方法具有較好的選擇性、重復性和抗干擾能力，采用手機記錄結果，便于數據傳輸，可及時將結果傳遞給分析人員，有望用于實際生物樣品中含巰基化合物的實時診斷。