碳量子點熒光探針的設計及其在農殘檢測中的應用進展

白秋月，楊春亮，葉劍芝，林麗云，陳吳海

(1.華中農業大學 食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.中國熱帶農業科學院 農產品加工研究所，廣東 湛江 524000)

農藥殘留是農藥使用后殘存于生物體、農副產品和環境中的微量農藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質的總稱[1]。在農業生產中，農藥是農作物增收增產的重要保障，但農藥的施用量及分解量失衡會造成嚴重的農藥殘留問題[2]。大部分農藥具有高毒性，殘留在大氣、土壤、水和農作物中會嚴重威脅人類健康及整個生態系統[3-4]，濫用農藥[5]將直接或間接地威脅人類的健康。食品中的農藥殘留除了影響消費者健康外，還與進出口貿易、國家聲譽，乃至社會安定密切相關。近年來，國內外因農藥殘留引發的食品安全問題接連不斷，已成為當今各國政府和社會各界廣為關注的焦點問題之一[6-7]。

殘留農藥的快速、準確定量檢測是監控農產品質量的重要手段。缺乏快速、靈敏、高效的監測技術已成為制約我國農畜產品貿易和生產發展的重要因素。為了攻克這一難題，研制低毒無公害的新型農藥，開發高靈敏度、高選擇性的農殘檢測新技術，對農藥使用量進行有效控制勢在必行[8]。已報道的農殘檢測技術如色譜法、酶聯免疫吸附法和電化學分析法等靈敏度高、準確性好，但通常較為耗時且需要復雜的前處理過程、昂貴的儀器設備和特定的操作技能，有時還需使用有毒溶劑[9-16]。如酶聯免疫吸附法成本高、抗體合成程序耗時，且易受周圍環境影響[17-18]；電化學分析法的電極修飾程序復雜，易受假陽性影響[19]。而基于碳量子點的熒光探針檢測技術易操作，不需大型儀器設備，且碳量子點合成原料豐富、價格經濟，在熒光探針的構建方面表現出巨大的潛力，故被科研工作者廣泛關注并研究。本文簡要論述了碳量子點的特性、合成原料及制備方法，重點對碳量子點的修飾策略及其構建的熒光探針在農殘檢測中的應用進行了詳細且全面的綜述。

1 碳量子點的合成

1.1 碳量子點的特性

碳量子點(CDs)一般是指至少在一維空間的尺寸小于 10 nm，能穩定發光的納米碳點，是一種分散性良好、表面富官能團的碳納米顆粒，是繼石墨烯、碳納米管以及富勒烯之后出現的一種以碳為骨架結構，以sp2雜化納米晶碳或無定形碳為核心的新型碳納米材料[20-23]。碳量子點具有獨特的發光性質，其發光具有尺寸和激發波長依賴性，并且具有高的穩定性，無光漂白現象，能有效克服有機染料發光不穩定，易光漂白的缺點。熒光碳量子點除了具備量子點的上述優點外，還具有光穩定性高，無“光閃爍”現象，表面易于功能化修飾以及制備材料來源廣泛等優勢。此外，因為碳量子點不含重金屬元素，所以其毒性很低，具有好的生物兼容性，不會引起重金屬污染；克服了硫化鎘等傳統無機量子點高毒、不利于廣泛應用的缺點[24]。以上的諸多優點，使碳量子點在食品安全分析領域表現出巨大的應用前景。到目前為止，碳量子點已經被成功應用于熒光傳感檢測[25-26]。

1.2 碳量子點的合成原料及制備方法

CDs的合成原料來源豐富，合成方法簡單。用物理法或化學法(如激光銷蝕法、弧放電法、電化學氧化法等)，以石墨、活性碳、碳納米管和納米金剛石作為碳源通過“自上而下”的方法剝離即可得到性能優越的CDs[27-28]；用化學法以碳水化合物如有機酸鹽(檸檬酸鹽、焦磷酸鹽)或糖類(葡萄糖、殼聚糖、阿拉伯糖、醋酸纖維素)為碳源，通過“自下而上”的方法也可以制備滿足各種用途的CDs[23,29-33]。目前CDs的合成方法包括水熱法、微波法、溶劑熱法、超聲法，在這些合成方法中，水熱法和微波法因可制備出粒徑高度均勻的CDs，且設備簡單、合成可控、效率高、適合大規模生產，故應用最廣泛[34-35]。近年來的研究顯示：相比于其它碳源，以天然產物為前體合成的CDs顯示出良好的發光穩定性、低毒性、良好的生物相容性和高溶解性，且成本低，合成路徑綠色環保[36]。

以天然產物為原料合成CDs時多采用水熱法。Wang研究組將木瓜粉作為天然碳源，采用水熱法制備的水溶性CDs和乙醇可溶性CDs，均表現出良好的生物相容性，其量子產率(QY)分別達18.98%和18.39%，可作為熒光探針檢測Fe3+，檢測限分別為0.48 μmol·L-1和0.29 μmol·L-1[37]。Somasundaram等將香蕉植物假莖的汁液與乙醇混合，制備得到高熒光強度的CDs，其QY高達48%，并對Fe3+具有高選擇性，檢測限低至6.4 nmol·L-1[38]。Shen等以紅薯為碳源，通過水熱處理合成了無毒、分散性好、QY達8.64%的CDs，并成功應用于活細胞中Fe3+的檢測[39]。以食用綠色植物西蘭花為碳源，一步水熱法合成CDs的方法簡單、綠色、成本低，在構建高靈敏熒光探針檢測Ag+時，檢測限為0.5 mmol·L-1，有望作為免標記Ag+檢測熒光探針用于環境水污染監測[40]。除用常見植物作為碳源合成CDs外，Zhang等以寧夏的太原煤為碳源，采用硝酸氧化輔助水熱法合成發綠色熒光的CDs，并依據Fe3+可與CDs表面的酚羥基形成復合物的原理，設計基于CDs 的熒光探針檢測Fe3+，檢出限低至0.67 μmol·L-1[41]。Zhan等將3-氨丙基三甲氧基硅烷與戊二醛混合合成硅摻雜的CDs，其QY達13.60%，且基于Cu2+對硅摻雜CDs具有選擇性熒光猝滅作用，建立了水樣中Cu2+的分析檢測方法，該法操作簡單、選擇性好、靈敏度高[42]。水熱合成方法便捷、高效、綠色，顯著提高了CDs的合成效率，因此可更方便地合成高性能的CDs用于構建功能化熒光探針。

相比于水熱法，采用微波法以天然產物為原料合成CDs的報道相對較少。用微波法處理蓮藕，可合成QY高達19.0%的氮摻雜碳點(N-CDs)。蓮藕切碎混合超純水攪拌，在微波爐(800 W)中加熱6 min，然后將溶液離心，過濾并透析。合成的N-CDs可靈敏檢測Hg2+，檢測限低至18.7 nmol·L-1，該探針成功用于污水實際樣品的監測[43]。Zhang等以草酸和尿素為混合碳源，微波法一步合成了氮摻雜的具有藍色熒光的CDs，并發現相比于單獨以草酸為碳源，用尿素進行氮摻雜得到的CDs可獲得更高的QY，且該CDs具有良好的溫敏熒光響應性質，有望作為溫敏性光學納米探針在細胞研究領域得到應用[44]。Wang等將天然無毒的羊毛清洗切成3～5 mm，與水混合后加入到微波消解罐中，200 ℃下加熱1 h，然后離心15 min，通過一步微波輔助熱解工藝制備了CDs。該合成方法簡單，且不含其它添加劑，制備的高性能CDs可應用于構建熒光探針檢測農殘[45]。微波輔助合成法加熱均勻、功率可調、反應時間短，因而極大地提高了CDs的合成效率。

2 碳點熒光探針的設計及其在農殘檢測中的應用

隨著CDs合成方法及表面功能化修飾技術的不斷發展，其熒光量子產率、熒光壽命、水溶性及生物兼容性等性能也極大地提高，并廣泛用于熒光檢測[26]。目前已有許多研究基于碳點的復合材料設計熒光探針，如摻雜碳點熒光探針、分子印跡聚合物包埋碳點熒光探針及酶抑制型碳點熒光探針等，且已成功用于農殘檢測。Larki等研究發現在殺螟硫磷存在下，CDs的熒光能明顯增強，并據此設計了基于CDs的熒光探針檢測殺螟硫磷[46]。Gao基于對硫磷可顯著增強CDs的熒光強度，設計了熒光增強型探針檢測對硫磷[47]。相反，Chang等基于對氧磷可猝滅CDs的熒光，設計了熒光猝滅型探針檢測蔬菜上的對氧磷[48]。

2.1 以摻雜碳點設計熒光探針用于農藥檢測

Li等以離子液體巰基乙酸N-甲基乙醇銨為前體合成S、N共摻雜的CDs，通過雙酶級聯催化反應引起該CDs的熒光猝滅，并以此構建用于高靈敏檢測農藥(西維因)的熒光探針，檢測限低至5 μg·L-1[58]。在該方法中，摻雜不僅增強了CDs熒光壽命，QY也由摻雜前的7%提高至12.5%，因此極大地提高了該熒光探針的檢測效率；另外，CDs摻雜后還可以提高檢測目標的選擇性，如用S、N摻雜CDs設計熒光探針能顯著增強農藥的選擇性。Zou等以L-半胱氨酸為C、N、S源，一步水熱法合成了N,S-CDs，并基于氟啶胺與N,S-CDs之間發生內濾效應猝滅N,S-CDs熒光的機理構建了該目標物的高靈敏檢測探針。該熒光探針可以成功用于土壤和蘋果等復雜實際樣品中氟啶胺的檢測[59]。元素摻雜的策略在改善CDs光學性能的同時還可以進一步改變其表面官能團，使其更容易功能化或有利于檢測目標的特異性識別。另外，目前報道的大多摻雜策略都是基于非金屬元素的摻雜，金屬元素摻雜也能大大改善CDs的光學性能，因此金屬元素摻雜的CDs構建的高效熒光探針的研究也正受到越來越多研究者的關注。

2.2 分子印跡聚合物包埋碳點的熒光探針用于農藥檢測

分子印跡聚合物(MIPs)是通過分子印跡技術合成對特定模板分子具有特異性識別能力和選擇性吸附的聚合物,通常稱為塑料抗體或仿生抗體[9]。MIPs作為受體或識別元件能通過特定設計的空腔對目標分析物進行識別[60]。通過MIPs包埋CDs設計熒光探針同時整合了MIPs的高選擇性作為目標物的識別部件和CDs的發光性能作為信號輸出基團，基于此可構建對特定目標分子識別并引起熒光傳感信號變化的一種功能復合物材料探針[61]。這些材料價格低，機械和化學穩定性高，且可重復使用，因此受到科研工作者的廣泛關注。

Ensafi等以橙汁為碳源通過水熱法制得CDs，以鹽酸異丙嗪(PrHy)為模板分子，環己烷為功能單體，通過反相微乳液法合成了碳點-分子印跡聚合物(CDs-MIPs)。CDs-MIPs的熒光強度與PrHy的濃度在2.0～250 μmol·L-1范圍內呈良好的線性關系，檢測限為0.5 μmol·L-1。將該法用于實際樣品中PrHy的檢測，回收率為96.4%～102%[62]。因此，當CDs和分子印跡技術的獨特性質相結合時，熒光探針的選擇性得到極大提高，其應用前景良好。另外，Liu及其團隊以甘薯皮為碳源制備生物質CDs，在功能單體和交聯劑的作用下通過溶膠-凝膠法合成聚合物，然后用乙醇和水洗去模板分子，得到CDs-MIPs。隨著目標分子土霉素濃度的增加，CDs-MIPs的熒光強度逐漸降低。該熒光探針已成功用于蜂蜜中土霉素的檢測，回收率為90.2%～97.3%，檢出限為15.3 nmol·L-1[63]。同樣，Liu采用溶膠-凝膠法設計了氨基修飾的CDs-MIPs，通過苯醚甲環唑農藥分子特異性結合聚合物的空腔引起檢測信號的變化，構建高特異性定量檢測苯醚甲環唑的高效熒光探針，檢出限低至0.93 μg·mL-1[64]。利用熒光共振能量轉移(FRET)的機理，也可設計高靈敏度、高選擇性、方法便捷的農殘檢測探針[65]。基于CDs和鍵合甲基紅染料的MIPs之間能產生FRET，Li研究團隊在氧化銦錫電極上制備MIPs，開發了一種新型分子印跡熒光探針來檢測復雜樣品中的樂果，該方法靈敏度高、選擇性高、穩定性好，檢出限低至0.018 nmol·L-1[25]。將CDs與量子點(QD)結合，Mohammad開發了一種雙發射介孔結構分子印跡熒光探針比率檢測烯唑醇 (DNZ)。在該探針設計中，二氧化硅納米球包裹的藍色熒光CDs作為內參信號，封裝在介孔二氧化硅孔洞里綠色熒光的QD作為響應信號。DNZ選擇性地猝滅QD的熒光，同時伴隨著綠色到藍色的顏色變化，根據熒光信號的藍移和強度的變化，可以高靈敏檢測DNZ[66]。該CDs/QD熒光探針結合了分子印跡技術的高選擇性和比率測定的準確性，另外MIP的介孔結構有效地解決了常規MIP結合位點少、比表面積小的問題。將該熒光探針應用于水和土壤樣品中DNZ的測定，獲得滿意的回收率。

MIPs包埋CDs的熒光探針在極大提高檢測目標特異性的同時，也使探針的可修飾性大大提高，從而有利于構建特定功能的高靈敏探針檢測農殘。但MIP傳感器存在聚合物可能不規則，且模板分子可能永久性被捕獲導致目標分子吸附性差的缺點。

2.3 酶抑制型碳點熒光探針用于農藥檢測

酶抑制型碳點熒光探針廣泛用于農藥的檢測。農藥作為抑制劑，可抑制酶的活性或作為重要的底物直接參與酶催化反應，間接影響熒光信號的強弱。酶的“Induced-Fit”關系使基于酶催化反應的農殘檢測方法具有較高靈敏度和良好的選擇性。如乙酰膽堿酯酶(AChE)、丁酰膽堿酯酶、胰蛋白酶、有機磷水解酶及酪氨酸酶等酶的應用已經引起越來越多的關注[67]。AChE和丁酰膽堿酯酶在農殘檢測中的應用較廣泛。在AChE抑制型熒光探針中，AChE可催化乙酰硫代膽堿生成含有化學反應性基團巰基的硫代膽堿(TCh)，該物質可與金屬陽離子或熒光納米材料發生特異性反應[68]。

3 總結與展望

碳點作為不含重金屬的熒光納米材料，其主要成分碳是構成生命體的元素之一，具有熒光強度高、水溶性好、耐光漂白、低毒性、生物相容性好等優點，在農殘檢測方面得到了越來越廣泛的研究，具有極大的應用潛力。然而，對碳點的研究利用仍處于初級探索階段，其結構組成、熒光機理尚不十分明確。在合成制備方面，原料的選擇多樣且方法靈活簡便，但多數仍僅限于實驗室合成，對其表面性能進行后續純化處理通常比較繁瑣和耗時，且影響熒光量子產率。在食品安全檢測應用方面，碳點構建的熒光探針由于具有響應速度快、價格低廉、無需大型儀器設備的特點，在該領域有很大的應用潛力；但在實際樣品分析時由于成分復雜，仍面臨許多挑戰；例如受共存干擾物的影響，檢測目標的特異性不強，檢測的靈敏度也有待提高；另外目前報道的大多數方法檢測目標單一，多組分同時檢測的報道非常少，需要進一步的研究探索。因此，合成產率高、穩定性好、性能更優越的碳點，通過尋找合適的原材料，并對合成方法進行優化，在降低成本的同時提高產率，是實現碳點大規模應用的關鍵。在構建碳點熒光探針方面，進行功能化及與其它方法(酶生物傳感器、免疫分析、分子印跡聚合物、電化學傳感器等)深度聯合能進一步拓寬應用范圍，構建靈敏度好、準確度高、特異性強的熒光探針，是碳點熒光探針的重要發展方向，這些方面的努力有望為食品安全監管提供有效的新技術和新方法。