豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒M蛋白/N蛋白間與N蛋白/3

鄭海紅 孫竹筠 叢雁方 張可煜 高飛 童光志

摘要：為獲得一種經(jīng)全長cDNA突變體拯救出的、隨著傳代次數(shù)的增多而最終致死的突變病毒，以嵌合感染性克隆p7AX12為骨架，分別在豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）M蛋白與N蛋白間或（和）N蛋白/3'UTR之間插入32 nt，依次構建4個嵌合突變體pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染Marc-145細胞后4個嵌合突變體均能拯救出病毒，且拯救病毒中的突變或插入的堿基具有遺傳穩(wěn)定性。突變病毒傳代5次，沒有最終致死的原因還有待于進一步研究分析。獲得的4個突變病毒也為研制PRRSV基因標識疫苗及PRRSV復制轉(zhuǎn)錄機制研究奠定了基礎。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）；M蛋白/N蛋白；N蛋白/3'UTR；反向遺傳操作

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2019）03-0010-04

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），是套式病毒目（Nidovirales）動脈炎病毒科（Arteriviridae）成員之一[1]。該病毒引起的豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）給中國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都帶來了巨大的經(jīng)濟損失。一直以來，免疫接種是控制豬繁殖與呼吸障礙綜合征的惟一有效措施，但由于目前現(xiàn)有的PRRSV傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗各自存在不同程度弱點，因此，高效安全的新型疫苗研發(fā)迫在眉睫[2]。隨著分子生物學技術的發(fā)展和對PRRSV認識的不斷深入，尤其是反向遺傳操作技術[3，4]的發(fā)展，給豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒新型疫苗的研制帶來了極大希望。

p7AX12（未發(fā)表質(zhì)粒）是以弱毒株pAPRRS[4]為母體，嵌合了強毒株JX143[5]的N蛋白，并且在基因組M蛋白/N蛋白間引入了外源序列（包括酶切位點、M蛋白與N蛋白重疊4個氨基酸），結果發(fā)現(xiàn)，由p7AX12拯救的嵌合病毒v7AX12，在系列傳代過程中，基因組M蛋白/N蛋白間引入的外源序列不具有遺傳穩(wěn)定性，出現(xiàn)外源序列逐漸被刪除現(xiàn)象。推測刪除機制可能是引入的M蛋白與N蛋白重疊序列與PRRSV原本存在的這段序列存在序列重復從而導致了外源序列的刪除，此現(xiàn)象類似于真核生物體內(nèi)一段序列兩翼若存在重復序列，這段序列往往被刪除的現(xiàn)象[6]。由此，本研究選擇N蛋白作為刪除目標，試圖構建一種突變?nèi)LcDNA克隆，轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，初期能拯救出病毒，隨著傳代次數(shù)的增多，由于N蛋白被逐步刪除緣故，病毒最終死亡。雖有文獻表明刪除序列大小與正向重復序列大小呈正相關[6]，但是PRRSV作為載體允許插入外源序列長短有限[7，8]。因此，本研究首先分別在N蛋白兩端插入相同的35個核苷酸，構建兩個全長cDNA克隆，然后在這兩個全長cDNA克隆都能拯救出相應突變病毒的前提下，又在N蛋白兩端同時插入這35個核苷酸，構建一個全長cDNA克隆，另外，本研究還構建了一個突變體，其N蛋白兩端不僅同時插入這35個核苷酸，且N蛋白起始密碼子ATG突變成ACG。本研究成功獲得了以上4個全長cDNA克隆，并對它們進行了病毒拯救與遺傳穩(wěn)定性特性分析。

1 材料與方法

1.1 細胞與質(zhì)粒

Marc-145、PRRSV全長感染性克隆pAPRRS[4]、強毒株全長感染性克隆pJXM143[5]以及p7PA3[9]、p7AX12由本研究室保存。細胞生長液為含10%胎牛血清（FBS，Gibco-BRL Cat# 16000）的DMEM（Gibco-BRL Cat# 12430），維持液為含2% FBS的DMEM。Top10感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司。

1.2 主要試劑

轉(zhuǎn)染試劑FuGENE？誖 HD購自Roche公司，PfuTurbo？誖 Hotstart DNA Polymerase購自Stratagene公司， QIAprep Spin Miniprep kit、QIAgen Viral RNA Mini Kit購自QIAGEN公司，AMV、rTaq購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶購自NEB公司， lexa Fluor？誖 568或者FITC標記羊抗鼠IgG二抗購自Invitrogen公司，免疫熒光試驗所用北美型PRRSV 抗N蛋白單克隆抗體由南達科他州立大學（South Dakota state university）方英博士惠贈。

1.3 引物

參照PRRSV弱毒株APRRS株（GeneBank登陸號：GQ330474）和強毒株JXM143株（GeneBank登錄號：EF488048）病毒基因組序列，利用Primer premier 5.0軟件設計引物，引物由上海英駿生物技術有限公司合成（表1）。

1.4 全長突變體的構建

以強毒株JXM143基因組為模板，用pfuTurbo？誖 Hotstart DNA Polymerase擴增，通過突變PCR法獲得含有在強毒株JX143 ORF7前加入35 nt（TTAATTAA

CCGGCGGCGCGCCACCATGCCGAACAA，下劃線堿基

為酶切位點，斜體為M蛋白與N蛋白間的重疊序列），然后借助p7PA3具有的酶切位點把目的片段替換到p7PA3中，構建pBJ327；通過兩輪重疊延伸PCR技術（Gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR）方法擴增出在強毒株JX143 N蛋白后加入35 nt（與N蛋白前加入的35 nt一致），隨后把目的片段連入topo載體中，構建中間質(zhì)粒topo-732，然后將成功構建的質(zhì)粒topo-732與全長質(zhì)粒pAPRRS用SpeI/XhoI進行雙酶切、再連接，構建全長pBJ732質(zhì)粒。以上述構建成功的質(zhì)粒topo-732為模板，通過突變PCR，獲得構建全長pBJD32和 pBJD32R所需突變PCR 片段，并將此突變PCR片段連入topo載體中，構建中間質(zhì)粒topo-D32和topo-D32R，最后將topo-D32、topo-D32R和pAPRRS用SpeI/XhoI雙酶切、再連接構建全長突變體pBJD32和pBJD32R。并用部分測序方法鑒定獲得的全長突變體pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R。

1.5 轉(zhuǎn)染

用QIAprep Spin Miniprep kit（QIAgen Inc.）試劑盒提取全長突變體質(zhì)粒pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R，采用分光光度計測定各質(zhì)粒濃度，確定轉(zhuǎn)染量為1 μg DNA的轉(zhuǎn)染體積。接種Marc-145細胞于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞密度約為80%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑為FuGENE？誖HD，轉(zhuǎn)染后置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。待Marc-145細胞出現(xiàn)病變且病變達80%左右時收取細胞上清（P0病毒上清）保存于-70 ℃，并在Marc-145細胞連續(xù)傳代5次，將每代病毒保存于-70 ℃。

1.6 間接免疫熒光試驗（Indirect immunofluorescence，IFA）

突變體質(zhì)粒pBJ327、pBJ732、pBJD32和 pBJD32R轉(zhuǎn)染Marc-145細胞72 h時，細胞經(jīng)冰甲醇固定10 min，1% BSA 封閉， 以抗PRRSV N蛋白的 MAb（1∶600）為一抗，羊抗鼠 IgG（1∶800）為二抗進行IFA試驗。具體操作見參考文獻[5]。

1.7 突變病毒基因組（genomic RNA，gRNA）的提取及鑒定

采用QIAamp Viral RNA試劑盒提取獲得的P5代突變病毒RNA。以提取的RNA為模板，SR15497為引物，用AMV反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應體系為25 μL：0.5 μL rTaq酶，10×PCR buffer 2.5 μL SF14413/SR15497為擴增引物各1 μL，cDNA 1 μL，補充ddH2O至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。獲得的突變病毒序列與PRRSV弱毒株APPRS株和強毒株JX143株進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 4個全長突變體構建成功

根據(jù)參考文獻[9]以及實驗室的前期工作，本研究采用突變PCR在PRRSV N蛋白的兩端分別或同時插入35 nt，依次構建了pBJ327、pBJ732、pBJD32、pBJD32R 4個全長cDNA，具體構建示意圖見圖1。pBJD32、pBJD32R 兩個全長突變體的不同點是pBJD32R是在pBJD32基礎上將N蛋白的起始密碼子ATG突變成了ACG。以上突變體獲得全長后，經(jīng)測序分析表明均與最初設計一致，證明成功獲得了4個全長突變體。

2.2 全長突變體轉(zhuǎn)染細胞結果

我們用FuGENE？誖 HD Transfection Reagent進行DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前先用QIAgen試劑盒抽提全長克隆質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染全長突變體劑量為1 μg。將Marc-145細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞密度約為80%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72 h時，IFA試驗結果顯示，pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R均能在胞漿內(nèi)檢測到N蛋白（圖2）。pBJ327、pBJ732、pBJD32R轉(zhuǎn)染后4 d出現(xiàn)細胞病變（CPE），而pBJD32轉(zhuǎn)染后7 d出現(xiàn)CPE（圖3）。拯救病毒分別命名為vBJ327、vBJ732、vBJD32、vBJD32R。結果表明，4個突變體轉(zhuǎn)染Marc-145細胞后，均能表達N蛋白且能拯救出相應的突變病毒，暗示突變病毒中的N蛋白在初期的拯救病毒中穩(wěn)定存在。另外，pBJD32R中的N蛋白起始密碼子的突變不影響突變病毒的拯救，暗示N蛋白使用的是引入的M蛋白與N蛋白重疊區(qū)中的起始密碼子ATG，這與Tan等[9]研究結果一致。

2.3 突變病毒基因組RT-PCR鑒定

將拯救病毒vBJ327、vBJ732、vBJD32、vBJD32R以低劑量感染MARC-145細胞，在MARC-145細胞上傳代5次，并對各代次病毒基因組進行RT-PCR鑒定，結果見圖4。擴增目的片斷為1 074 bp，將擴增的目的片段與pBS-T載體相連，篩選陽性重組子送上海英駿生物技術有限公司進行測序，采用DNAStar軟件與親本感染性克隆pJXM143和pAPRRS進行比對，結果所有嵌合病毒的基因序列均穩(wěn)定地存在于至少5代的子代嵌合病毒中，并未發(fā)現(xiàn)其他突變，具體序列比對見圖5。結果表明，獲得突變病毒經(jīng)系列傳代，并未出現(xiàn)N蛋白刪除的現(xiàn)象，且所有的突變位點都具有遺傳穩(wěn)定性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與p7AX12相比，在構建pBJ327時，通過同義突變致使M蛋白/N蛋白間引入的M蛋白/N蛋白重疊序列與PRRSV本身的M蛋白/N蛋白重疊序列不完全重復，由此，推測pBJ327拯救的病毒vBJ327未出現(xiàn)外源序列刪除現(xiàn)象，而p7AX12拯救的突變病毒v7AX12中外源序列出現(xiàn)刪除現(xiàn)象，這可能與重復序列的重復程度相關，初步證明重復的序列必須完全一致，才能使重復序列間的序列被刪除。但本研究遺憾的是vBJD32和vBJD32R連續(xù)性傳代并未出現(xiàn)N蛋白刪除現(xiàn)象，推測出現(xiàn)刪除與否還可能與正向重復序列長度以及重復序列間的間隔序列長度相關。因此，在下一步試驗將構建含有不同長度的重復序列以及間隔序列長度不一的突變體來驗證。本研究結果也為進一步研究PRRSV亞基因組的不連續(xù)性轉(zhuǎn)錄機制奠定了基礎[9]。

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