動物抗病毒藥殘留檢測方法研究進(jìn)展

趙海忠 李良華 宋忠旭 孫華 彭先文 梅書棋

摘要：針對最常用的兩種動物抗病毒藥物金剛烷胺和利巴韋林，闡述了其抗病毒作用機(jī)理及在動物體內(nèi)的殘留，歸納總結(jié)了藥物殘留儀器分析法和生物分析法檢測技術(shù)的進(jìn)展，結(jié)合抗病毒藥物殘留檢測重要性和實踐應(yīng)用前景提出應(yīng)發(fā)展ELISA檢測方法。

關(guān)鍵詞：抗病毒藥；殘留檢測；動物組織

中圖分類號：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2019）03-0014-03

隨著畜禽集約化飼養(yǎng)程度提高，動物感染病毒致死的比率高達(dá)36.8%[1]，人用抗病毒藥物由于價格低、療效好曾被報道廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中[2-4]，尤其金剛烷胺類和利巴韋林應(yīng)用最多、效果最顯著。病毒能夠通過基因的交換與重組對藥物產(chǎn)生抗性，病毒耐藥性的產(chǎn)生對人形成潛在威脅，并嚴(yán)重影響藥物對人的治療作用[5，6]。因此，我國農(nóng)業(yè)部第560號公告明令禁止動物使用金剛烷胺、金剛乙胺、嗎啉（雙）胍（病毒靈）、利巴韋林等抗病毒藥物，2005年還發(fā)布《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，要求禁止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用金剛烷胺等抗病毒藥物防治高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病。美國食品藥物管理局2006年即禁止在雞、鴨等動物中使用金剛烷胺等抗流感病毒的藥物。但生產(chǎn)中違規(guī)濫用仍存在，必須加強(qiáng)藥物殘留檢測。動物源性食品中抗病毒藥物殘留的檢測方法主要有儀器分析法和生物分析法。本文通過對金剛烷胺和利巴韋林兩種抗病毒藥物抗病毒作用機(jī)理的詮釋以及在動物體內(nèi)殘留特性，介紹了藥物殘留檢測技術(shù)的進(jìn)展，旨在改進(jìn)和研發(fā)靈敏性、便利性的檢測方法來監(jiān)測動物源食品中抗病毒藥物的殘留，切實保障人類食品安全水平不斷提高。

1 抗病毒藥物的分類和機(jī)理

抗病毒藥物不破壞病毒體，也不損傷宿主細(xì)胞，主要作用在于抑制病毒的增殖，輔助宿主免疫系統(tǒng)抵御病毒侵襲，修復(fù)被破壞的組織，緩和病情使之不出現(xiàn)臨床癥狀。常見的抗病毒藥物主要分為四類[2]。金剛烷胺類藥物抑制病毒復(fù)制初期，主要通過阻斷病毒基因的脫殼，使病毒核酸不能進(jìn)入宿主細(xì)胞，抑制病毒復(fù)制，保護(hù)宿主抵御病毒侵襲。神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物主要通過抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，阻止子代病毒顆粒在宿主細(xì)胞的復(fù)制和釋放，減少病毒的持續(xù)時間，如奧司他韋。核苷類藥物在病毒復(fù)制過程中，藥物競爭性地與病毒DNA聚合酶或RNA聚合酶相結(jié)合，從而抑制酶活性，干擾病毒核酸的合成，產(chǎn)生抗病毒作用，如利巴韋林。廣譜抗病毒類藥物對多種病毒增殖期的各個環(huán)節(jié)都有作用，如嗎啉胍等。畜禽養(yǎng)殖中使用最廣泛、效果最顯著、最具代表性的抗病毒藥物為金剛烷胺和利巴韋林。

2 抗病毒藥物在動物體內(nèi)的殘留

抗病毒藥物在動物體內(nèi)多以原型存在，但含量高低不同。不同的抗病毒藥物在動物體內(nèi)的代謝途徑及代謝產(chǎn)物存在差異[7]。金剛烷胺在動物體內(nèi)發(fā)生降解代謝的量極少，90%以原型經(jīng)腎小球濾過隨尿排出，部分可被再吸收。利巴韋林在動物體內(nèi)以原型的代謝形式占多數(shù)[8]。在獸藥殘留檢測中主要針對的是可食性組織如肌肉、肝臟等。實際檢測過程中檢出原型即能滿足監(jiān)管要求，可不采用酶解，以簡化步驟，提高監(jiān)測效率。

3 抗病毒藥物殘留檢測的儀器分析法

3.1 氣相色譜法（GC）

氣相色譜法是以氣體為流動相的色譜過程，具有分離效率高、分析速度快、選擇性較好、樣品用量少、檢測靈敏度較高、操作簡單、費用低等優(yōu)點。20世紀(jì)60年代氣相色譜法廣泛應(yīng)用于獸藥殘留分析，大大提高了獸藥殘留量的檢測精度。目前，該法已成為最典型、應(yīng)用最廣的分析方法。Yao等[9]檢測金剛烷胺檢出限達(dá)2 ng/mL。

3.2 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）是現(xiàn)代分離測定的重要手段，幾乎所有的化合物和大分子物質(zhì)均可用HPLC進(jìn)行測定。該方法不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，其分離機(jī)制與常規(guī)色譜柱相同，但填料更加精細(xì)（0.5～10.0 μm），在殘留檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用，但存在溶劑消耗量大、色譜柱價格較貴、污染環(huán)境等不足。

3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）

80%以上的抗病毒藥物殘留檢測方法均是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其具有分離效果好、靈敏度高、檢出限低、回收率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。Berendsen等[10]檢測金剛烷胺、利巴韋林等，其定量限為1～10 μg/kg。

3.4 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）在LC-MS/MS基礎(chǔ)上發(fā)展而來。云環(huán)等[11]采用HPLC-MS/MS檢測肌肉組織中的金剛烷胺和利巴韋林，檢測限為4.0 μg/kg，并在1.0～50.0 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率75.9%～108.5%。王維霞[12]采用HPLC-MS/MS檢測雞肉組織中利巴韋林殘留量，檢出限為2.0 ng/g且在1.0～50.0 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，操作簡便快捷且準(zhǔn)確度高。Higashi等[13]采用HPLC-MS/MS檢測大鼠血漿中金剛烷胺等抗病毒藥物，檢測限為0.025 ng/mL，回收率高于95%。

3.5 液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-ESI-MS/MS）

Liu等[14]建立了LC-ESI-MS/MS檢測雞肉組織中金剛烷胺等殘留量，最低檢出限為0.06～0.30 μg/kg，雞肝中為0.2～1.0 μg/kg，雞肉中平均回收率為72.3%～94.2%，雞肝中為70.8%～92.7%，靈敏度高，準(zhǔn)確性好。

國內(nèi)儀器方法上建立了金剛烷胺等抗病毒藥物的檢測標(biāo)準(zhǔn)并用于定性、定量的檢測實施。儀器方法具有高精密度和準(zhǔn)確度，且能同時進(jìn)行多殘分析，但儀器昂貴，樣品前處理繁瑣，需要專業(yè)人員操作，更適用于科研機(jī)構(gòu)和國家權(quán)威部門對藥物的確認(rèn)檢測。

抗病毒藥物儀器檢測法研究進(jìn)展見表1。從表1中可以看出，方法的檢出限在0.06～25.00 μg/kg，能較好地滿足抗病毒藥物殘留檢測分析方法的要求。

4 抗病毒藥物殘留檢測的生物分析法

生物分析法包括免疫法、受體法等。孫海新[5]通過分子生物學(xué)方法建立了金剛烷胺受體蛋白表達(dá)系統(tǒng)，以評價受體蛋白的親和活性提出其作為金剛烷胺生物識別材料的潛力。通過優(yōu)化親和檢測體系參數(shù)，最后達(dá)到IC50為459 ng/mL，與金剛乙胺的交叉反應(yīng)率為72%。檢測回收率在74%～104%，批內(nèi)變異系數(shù)為5.0%～19.0%，批間變異系數(shù)為6.5%～15.5%。這種通過親和力受體識別藥物的想法創(chuàng)新但各方面技術(shù)尚不成熟，對藥物識別的靈敏度不高。

免疫分析法根據(jù)待測藥物的共性結(jié)構(gòu)或共有結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計并合成突出其結(jié)構(gòu)特征的半抗原，半抗原與大分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)后作為全抗原并免疫動物，通過細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞，收集并純化雜交瘤細(xì)胞分泌的類特異性抗體，利用抗體建立免疫分析法。酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）具有成本低、易操作、高效率、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，適用于大批量樣品的篩選。目前ELISA方法廣泛應(yīng)用于氨基糖苷類抗生素[25]等獸藥殘留檢測，但對金剛烷胺類和利巴韋林殘留檢測未見文獻(xiàn)報道，研究并制備抗病毒藥物的有效ELISA檢測方法十分有必要。

5 結(jié)語

縱觀金剛烷胺和利巴韋林殘留檢測的實踐與發(fā)展，盡管儀器監(jiān)測是最主要的方法，但不適用于高通量篩選，發(fā)展起來的ELISA方法因其簡單、方便、靈敏度高、特異性好，順理成章成為當(dāng)前世界推行的高通量篩選方法。在養(yǎng)殖實踐中，受儀器與專業(yè)人員的局限，如研制出抗病毒藥物ELISA檢測試劑盒，能夠快速、準(zhǔn)確進(jìn)行殘留檢測，將發(fā)揮重要的作用，并具有廣闊應(yīng)用前景。

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