藍(lán)莓汁花色苷指紋圖譜鑒偽可行性分析

潘少香，閆新煥，譚夢男，劉雪梅，孟曉萌，鄭曉冬，李志成，曹寧

（中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南 250014）

藍(lán)莓（Blueberry）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.），多年生落葉或常綠灌木小漿果，原產(chǎn)于北美[1-3]。藍(lán)莓是越橘屬植物中營養(yǎng)成分最豐富的種類，除含常規(guī)的有機(jī)酸、糖以外，還富含維生素A、E、B 以及多種微量元素，并且富含多種黃酮類、花色苷、多酚類化合物等成分，具有抗氧化活性、抗癌、降低膽固醇、延緩衰老等多種藥理活性[4,5]。以藍(lán)莓為代表的漿果類水果有“黃金水果”的美譽(yù)，但由于產(chǎn)量低、保鮮難度和成本較高，主要以加工為主，鮮食不足50%[6]。目前，藍(lán)莓多被加工成果汁、濃縮果汁、果醬等。國內(nèi)果汁行業(yè)正以平均每年20%的增長率增長，成為食品方面發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)[7]，漿果汁及其復(fù)合飲料市場份額不斷增長，形成了新的果汁消費(fèi)市場。近年來，國內(nèi)各大果汁飲料廠開始重視漿果果汁的生產(chǎn)，但由于產(chǎn)量低、成本高，漿果果汁摻假、造假、錯誤標(biāo)簽等導(dǎo)致的食品質(zhì)量和安全爭議不斷發(fā)生，果汁真?zhèn)舞b別技術(shù)面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，常用的漿果真?zhèn)螜z測方法，一是基因技術(shù)，利用PCR 技術(shù)對果汁中未知物進(jìn)行鑒偽篩查[8-10]；二是同位素分析法，利用質(zhì)譜或核磁技術(shù)對果汁中C、H、O 等同位素特征比例精確測定外源添加物含量[11-13]。這些方法在漿果果汁鑒定上有一定的準(zhǔn)確性，但過程相對繁瑣，不易實現(xiàn)，尤其是測定多品種混合的果汁，方法的準(zhǔn)確性、靈敏度和檢測范圍將會受到很大限制。市售漿果果汁飲品售價高昂且質(zhì)量參差不齊，消費(fèi)者又很難通過簡單的感官判斷加以鑒別，而現(xiàn)行分析檢測技術(shù)方法無法完全滿足上述要求。因此，亟需一種快捷、可靠的漿果果汁摻偽識別技術(shù)。

近年來，特征性化學(xué)成分的識別是漿果及其果汁檢測中興起的一個熱點。通過特征成分檢測或建立特征成分指紋圖譜來進(jìn)行果汁鑒偽的研究較多，但由于果汁中化合物天然含量較低和廣泛的物種變異性，效果不理想。藍(lán)莓中花色苷種類多，含量高[14,15]，在特征成分指紋圖譜鑒偽方面有很大的優(yōu)勢，本研究針對市售藍(lán)莓汁中經(jīng)常使用樹莓汁、石榴汁、葡萄汁等進(jìn)行以次充好現(xiàn)象，利用液相色譜技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)統(tǒng)計分析方法，建立了藍(lán)莓汁中花色苷的快速高效指紋圖譜鑒偽技術(shù)，為藍(lán)莓果汁的質(zhì)量控制提供一種有效的方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮的藍(lán)莓、石榴、樹莓樣品，均購買于濟(jì)南歷下大潤發(fā)超市。

乙腈為色譜純，Thermo fisher USA；甲酸為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；實驗用水均為超純水，18.2 MΩ。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000 反相高效液相色譜儀（Thermo fisher，USA），包括自動進(jìn)樣器、柱溫箱和DAD 檢測器；明澈D24 UV超純水儀，美國Millipore；破壁料理機(jī)，九陽JYL-Y15；KQ-500E 超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 供試品制備

為保證果汁的真實性，試驗所用藍(lán)莓汁、石榴汁和樹莓汁均由實驗室自制，將藍(lán)莓、樹莓分別放入破壁料理機(jī)中打漿，漿體直接壓榨取汁。石榴汁由石榴籽粒直接壓榨取汁制得。將純果汁和水1：2 稀釋混勻后，以5000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，過0.45 μm 濾膜，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓汁花色苷檢測方法優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

液相流動相選擇甲酸/水和乙腈，經(jīng)試驗優(yōu)化后液相色譜條件如下：選用AcclaimTM120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相A，10%甲酸/水；流動相B，水：甲酸：乙腈=4：1：5；紫外線檢測波長530 nm；流速為1 mL/min；柱溫40 ℃。液相色譜洗脫條件采用梯度洗脫（見下頁表1），優(yōu)化后藍(lán)莓汁花色苷色譜圖如圖1（見下頁）所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The conditions of gradient elution

圖1 藍(lán)莓汁花色苷色譜圖Fig.1 Anthocyanin chromatogram of blueberry juice

從圖1 中可以看出，藍(lán)莓汁花色苷存在7 個色譜峰，分 別 出 現(xiàn) 在 9.370、16.383、18.653、19.237、20.558、21.310、23.693 min 處。7 種花色苷能夠明顯分開，該方法的分離度較好。

2.1.2 花色苷檢測方法學(xué)考察

（1）精密度

同一藍(lán)莓汁樣品，連續(xù)檢測6 次，記錄上述7 種花色苷色譜圖峰面積，計算各成分峰面積的RSD，由于精密度和穩(wěn)定性的檢測方法相同，且精密度對進(jìn)樣時間沒有要求，因此精密度和穩(wěn)定性使用同一組數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2，花色苷的RSD 均小于1.5%，精密度良好。

（2）穩(wěn)定性

取藍(lán)莓汁供試樣，按上述色譜方法，每隔2 h 進(jìn)一針，連續(xù)檢測6 次，記錄上述7 種花色苷色譜圖峰面積，計算各成分峰面積的RSD，結(jié)果見表2。從表2 中可以看出，7 種花色苷的RSD 均小于1.5%，說明花色苷供試溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（3）重復(fù)性

按1.3 項中的方法制備6 個藍(lán)莓樣品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣測定，測試結(jié)果見表3。從表3 可以看 出， 樣 品 中 9.370、16.383、18.653、19.237、20.558、21.310、23.693 min 處的色譜峰面積RSD 分別為2.8%、2.8%、3.2%、5.7%、1.5%、4.7%、2.9%。7 個色譜峰的峰面積RSD 均在6%以內(nèi)，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.2 常見摻假果汁指紋圖譜色譜峰比對

將藍(lán)莓汁中常見的摻假果汁石榴汁和樹莓汁按照上述樣品處理和檢測方法操作，比較三種樣品花色苷色譜圖，結(jié)果見圖2。

從圖2 中可以看出，石榴汁中花色苷數(shù)量只有4 種，分別出現(xiàn)在5.93、8.657、11.923、12.757 min 處，樹莓汁中峰形較明顯的花色苷有5 種，分別出現(xiàn)在11.223、12.867、18.243、19.700、23.283 min 處。比較藍(lán)莓汁、石榴汁、樹莓汁三種果汁花色苷色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，每種果汁花色苷色譜圖出峰時間及峰面積各不相同，均具有特異性。

表2 方法精密度和穩(wěn)定性Table 2 Method precision and stability

表3 方法重復(fù)性Table 3 Method repeatability

圖2 藍(lán)莓汁、石榴汁和樹莓汁的花色苷液相色譜圖Fig.2 Anthocyanin liquid chromatogram of blueberry juice,pomegranate juiceand raspberry juice

2.3基于化學(xué)計量學(xué)方法的花色苷指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

2.3.1 花色苷指紋圖譜數(shù)據(jù)化

利用上述方法檢測藍(lán)莓、石榴、樹莓供試液中的花色苷，每個樣品重復(fù)一次，記錄花色苷的出峰時間和峰面積，結(jié)果見表4（見下頁）。將花色苷指紋圖譜數(shù)據(jù)化，便于進(jìn)一步結(jié)合計量學(xué)方法進(jìn)行分析，能夠更加直觀地反映出不同樣品花色苷的差異。

從表4 中可以看出，藍(lán)莓、石榴、樹莓三種樣品的花色苷品種和含量各不相同。從藍(lán)莓、石榴、樹莓三種樣品中共檢測出16 種花色苷，為了更加直觀地反應(yīng)三種樣品的差異，采用降維分析法中的主成分分析法以及聚類分析法對三種樣品做進(jìn)一步的分析。

2.3.2 花色苷指紋數(shù)據(jù)主成分分析

采用SPSS 25.0 對不同樣品不同保留時間的花色苷峰面積做主成分分析，選取兩個主成分，主成分的特征向量和載荷見表5（見下頁）。

從表5 中可以看出，第一主成分中貢獻(xiàn)率比較大的成分是保留時間為9.76、16.383、18.653、19.237、23.693 min 處的色譜峰，這5 種色譜峰在藍(lán)莓汁中出現(xiàn)，未在石榴汁和樹莓汁中出現(xiàn)，是藍(lán)莓汁的特征花色苷峰，這說明第一主成分主要反映的是藍(lán)莓汁花色苷的變異信息。石榴汁和樹莓汁花色苷色譜峰在第二主成分有較高的響應(yīng)，說明這一主成分主要反映的是石榴汁和樹莓汁花色苷的變異信息。以第一主成分值為橫坐標(biāo)，第二主成分值為縱坐標(biāo)做散點圖（見第11 頁圖3）。第一、第二主成分綜合貢獻(xiàn)率達(dá)到95%，說明前兩個主成分基本上可以解釋大部分花色苷含量的變異信息。從主成分分析圖中可以看出，不同樣品在主成分分析圖中能夠明顯的分開，且根據(jù)品種劃分為三個區(qū)域分布在不同的象限中，說明三個品種的果汁中花色苷種類和含量存在顯著的差異。

表4 藍(lán)莓汁、石榴汁、樹莓汁花色苷保留時間及峰面積Table 4 Retention time and peak area of anthocyanin in blueberry juice, pomegranate juice and raspberry juice

表5 2 個主成分的特征向量和載荷Table 5 Principal component eigenvectors and loading matrix

圖3 三種果汁主成分散點圖Fig.3 PCA biplot of three juice

2.3.3 花色苷指紋圖譜數(shù)據(jù)聚類分析

采用SPSS 25.0 對不同樣品不同保留時間的花色苷峰面積做聚類分析，聚類分析結(jié)果見圖4。從聚類樹狀圖中可以看出，藍(lán)莓、石榴、樹莓樣品能夠明顯的分為三類，每個品種自動聚為一類，說明三種樣品的花色苷指標(biāo)存在明顯的差距。同時從聚類分析圖中可以看出藍(lán)莓汁色譜圖與石榴汁和樹莓汁的間距都比較大，這說明藍(lán)莓汁花色苷指紋圖譜的特異性較大。

圖4 三種果汁聚類分析樹狀圖Fig.4 The cluster analysis diagram of three kinds of fruit juice

3 討論

3.1 藍(lán)莓汁花色苷提取方法的選擇

為提高花色苷的提取率，一般采用有機(jī)試劑乙醇、甲醇等對樣品進(jìn)行提取[14,16]，本實驗研究目的在于鑒偽，無需考慮樣品中花色苷具體含量的高低，因此選擇將樣品直接稀釋過濾上機(jī)，這樣可以避免樣品在提取過程中造成的差異，同時避免提取物質(zhì)雜峰對鑒偽花色苷成分的干擾。

3.2 藍(lán)莓花色苷指紋圖譜檢測方法的建立

本試驗建立的藍(lán)莓花色苷指紋圖譜檢測方法穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度良好，能夠檢測出藍(lán)莓汁中特征花色苷成分，并且分離度良好，同時對石榴汁和樹莓汁樣品進(jìn)行了檢測，也能夠檢出并分離開石榴汁和樹莓汁樣品中的花色苷成分，這充分說明了藍(lán)莓花色苷指紋圖譜檢測方法的有效性。

3.3 不同果汁指紋圖譜色譜峰比對

對藍(lán)莓汁、石榴汁和樹莓汁三種果汁的花色苷指紋譜圖和數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對，并利用分析軟件進(jìn)行了主成分分析和聚類分析，聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果相符，結(jié)果表明三種果汁的花色苷指紋圖譜具有較大的差異性，能夠得到明顯的區(qū)分，這說明不同樣品花色苷真實性評價是可行的，花色苷指紋圖譜可以作為藍(lán)莓汁真?zhèn)舞b別的依據(jù)。