miRNAs及血清神經元PAS結構域蛋白4、神經元特異性烯醇化酶、S100β蛋白水平與急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的關系研究

郭萬申，李志方

急性腦卒中是臨床常見疾病，具有發病率高、致殘率高、病死率高等特點［1］，常伴有認知功能損傷甚至癡呆［2-3］。認知障礙指不同類型、程度認知功能減退，可影響急性腦卒中患者主動參與社會活動、配合肢體功能訓練及生活質量［4-5］，一般分為輕度、中度、重度，其中重度認知障礙被稱為血管性癡呆且較難治愈，因此輕、中度認知障礙是急性腦卒中患者防治工作的重點之一［6-7］。

miRNAs是一類全長約18～24個核苷酸非編碼單鏈小分子RNA，可參與基因轉錄調控，用于疾病預測、診斷和預后評估［8］。近年來有研究表明，miRNA-34、miRNA-21、miRNA-135等多種miRNAs可用于判斷患者認知功能［9-10］。神經元PAS結構域蛋白4（NPAS4）在抑制性突觸發育過程和應激誘導海馬損傷中發揮重要作用，NPAS4水平下降導致突觸可塑性缺失，引起認知功能損傷［11-12］。神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）能夠高靈敏地反映腦損傷嚴重程度［13］。S100β蛋白是一種酸性鈣結合蛋白，主要分布于中樞神經系統的神經膠質細胞，是反映早期腦損傷的重要標志物［14］。本研究旨在分析miRNAs及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平與急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月—2018年5月解放軍三零七醫院神經內科收治的急性腦卒中并認知障礙患者146例，均符合急性腦卒中、認知障礙的診斷標準［2-3］。納入標準：經顱腦CT或磁共振成像確診，且臨床資料完整者；文化程度為初中及以上者；首次發病且于3 d以內入院者；發病前意識清楚且無認知障礙。排除標準：合并其他神經系統疾病；發病前有顱腦或精神創傷者。根據認知障礙嚴重程度將所有患者分為輕度組（n=101）、中度組（n=30）、重度組（n=15）。3組患者性別、年齡、受教育年限及高血壓、糖尿病、高脂血癥發生率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1），具有可比性。本研究經解放軍三零七醫院醫學倫理委員會審核批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 認知障礙嚴重程度分級標準 采用簡明精神狀態量表（Minimum Mental State Examination，MMSE）評分評價兩組患者認知功能，該量表包括時間定向力、地點定向力、語言、視空間、即刻記憶、延時記憶、注意力及計算力7個條目，總分30分。MMSE評分21～26分為輕度認知障礙；MMSE評分10～20分為中度認知障礙；MMSE評分＜10分為重度認知障礙。

1.3 miRNAs檢測方法 所有患者入院后采集靜脈血3～5 ml，采用RNA提取分離試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司生產〕提取全血總RNA，逆轉錄為cDNA，取2 μl cDNA并采用美國ABI公司生產的實時定量PCR儀進行擴增，擴增條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環，72 ℃延伸 5 min；PCR試劑購自日本TAKARA公司。以U6為內參基因（上游序列：5'-AGTTTCCAGTCCTTACGCTTC-3'；下游序列：5'-GGCCTTAACCTAATTCCGGG-3' ），采用2-ΔΔCT法計算miRNAs相對表達量，包括miRNA-34、miRNA-21、miRNA-135。

1.4 血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平檢測方法所有患者入院第2天早晨抽取空腹靜脈血3～5 ml，自然凝固 30 min 后常溫 3 000 r/min 離心 10 min（離心半徑15 cm），分離血清，置于-70 ℃低溫冰箱保存待測。采用酶聯免疫吸附法檢測血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平，試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，嚴格按照說明書進行操作。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，滿足正態分布和方差齊性的計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗；miRNAs相對表達量及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平與急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的相關性分析采用Spearman秩相關分析；繪制ROC曲線以評價miRNAs相對表達量及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平對急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的評估價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 3組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information in the three groups

2 結果

2.1 miRNAs相 對 表 達 量 及 血 清 NPAS4、NSE、S100β蛋白水平 3組患者miRNA-34、miRNA-21、miRNA-135相對表達量及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。重度組 患 者 miRNA-34、miRNA-21、miRNA-135相 對 表達量及血清NSE、S100β蛋白水平低于輕度組和中度組，血清NPAS4水平高于輕度組和中度組，差異有統計學意義（P＜0.05）；中度組患者miRNA-34、miRNA-21、miRNA-135相對表達量及血清NSE、S100β蛋白水平低于輕度組，血清NPAS4水平高于輕度組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 3組患者miRNAs相對表達量及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of miRNAs，serum levels of NPAS4，NSE and S100β protein in the three groups

表2 3組患者miRNAs相對表達量及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of miRNAs，serum levels of NPAS4，NSE and S100β protein in the three groups

注：NPAS4=神經元PAS結構域蛋白4，NSE=神經元特異性烯醇化酶；與輕度組比較，aP＜0.05；與中度組比較，bP＜0.05

S100β蛋白（μg/L）輕度組 101 0.26±0.02 0.19±0.04 0.73±0.14 2.10±0.40 12.49±1.49 0.18±0.02中度組 30 0.18±0.04a 0.14±0.10a 0.45±0.11a 4.20±0.55a10.48±1.66a0.14±0.09a重度組 15 0.09±0.03ab 0.10±.07ab0.24±0.22ab6.78±1.01ab8.10±1.30ab0.08±0.01ab組別 例數 miRNA-34 miRNA-21 miRNA-135 NPAS4（mg/L）NSE（U/ml）F值 14.502 8.911 13.096 11.032 7.402 5.886 P 值 ＜0.01 0.001 ＜0.01 ＜0.01 0.007 0.012

2.2 相關性分析 Spearman秩相關分析結果顯示，miRNA-135相對表達量及血清NSE、S100β蛋白水平與急性腦卒中患者MMSE評分呈正相關（rs值分別為 0.420、0.434、0.465，P＜0.05），血清NPAS4水平與急性腦卒中患者MMSE評分呈負相關（rs=-0.448，P＜0.01）。

2.3 評估價值 ROC曲線分析結果顯示，miRNA-135相對表達量評估急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的曲線下面積（AUC）為0.747，最佳截斷值為 0.71；血清NPAS4水平評估急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的AUC為0.729，最佳截斷值為2.01 mg/L；血清NSE水平評估急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的AUC為0.751，最佳截斷值為13.00 U/ml；血清S100β蛋白水平評估急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的AUC為0.755，最佳截斷值為0.19 μg/L，詳見表3、圖1。

表3 3組患者miRNA-135相對表達量及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平對急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的評估價值Table 3 Estimated value of relative expression quantity of miRNA-135，serum levels of NPAS4，NSE and S100β protein on severity of cognitive disorder in patients with acute stroke

圖1 miRNA-135相對表達量及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平對急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度評估價值的ROC曲線Figure 1 ROC curve for relative expression quantity of miRNA-135，serum levels of NPAS4，NSE and S-100β protein in estimating the severity of cognitive disorder in patients with acute stroke

3 討論

急性腦卒中患者認知障礙主要與血管閉塞或血流量減少而導致腦細胞缺乏氧氣和營養有關，可進展為血管性癡呆并導致腦部小血管病變、血管管壁增厚、血-腦脊液屏障保護功能受損、血管灌注功能下降等，臨床主要表現為思維遲鈍、邏輯能力降低、記憶力下降等，且認知障礙患者發展為癡呆風險約是正常人10倍［15-16］，因此早期診斷急性腦卒中患者認知障礙并判斷其嚴重程度具有重要意義。

目前，急性腦卒中患者病死率有所下降，但部分預后較差患者易出現認知障礙［17-18］。急性腦卒中患者認知障礙是受多基因調控的過程，涉及多種信號轉導途徑，進而激活生物大分子活性，產生一系列生理、心理反應［19-20］。miRNAs是一類真核生物內源性小分子單鏈RNA，其可抑制靶蛋白合成或誘導靶mRNA降解，海馬組織中miRNAs表達較豐富，參與神經系統不同信號通路基因調控，在大腦學習與記憶功能中起重要作用，也用于血管性癡呆患者早期診斷［21-22］。有研究表明，miRNA-34、miRNA-21可降低淀粉樣蛋白前體及淀粉樣蛋白前體同源物水平，從而促進認知障礙病情發展；miRNA-135可抑制突觸核蛋白水平，對神經有保護作用［23-24］。本研究結果顯示，重度組患者miRNA-34、miRNA-21、miRNA-135相對表達量低于輕度組和中度組，中度組患者miRNA-34、miRNA-21、miRNA-135相對表達量低于中度組，Spearman秩相關分析結果顯示，miRNA-135相對表達量與急性腦卒中患者MMSE評分呈正相關，提示miRNA-34、miRNA-21、miRNA-135相對表達量隨急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度改變而變化，且miRNA-135相對表達量與急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度有關。

急性腦卒中患者認知障礙發生機制較復雜，但血清中一些炎性標志物的變化可為早期診斷及治療提供參考［25］。NPAS4在海馬組織中有較高水平，其參與調節神經元存活、突觸發育、海馬組織中樹突細胞骨架形成及突觸可塑性的轉錄調控等，具有神經保護作用［26］。NPAS4可通過Ca2+內流而被選擇性誘導，啟動抑制性突觸形成開始，調控功能依賴性基因，促進病態抑制性突觸恢復［27］。本研究結果顯示，重度組患者血清NPAS4水平高于中度組和輕度組，中度組患者血清NPAS4水平高于輕度組，血清NPAS4水平與急性腦卒中患者MMSE評分呈正相關，提示血清NPAS4水平越高，急性腦卒中患者認知障礙程度越重；分析其發生機制可能是NPAS4參與腦卒中患者腦缺血、缺氧、認知障礙的整個過程，且嚴重擾亂機體生理、心理平衡，影響神經元生成，造成海馬形態學改變，進而引發認知障礙［28］。

NSE是神經元和神經內分泌細胞中的一種關鍵酶，是中樞神經系統特異性標志物，腦細胞損傷時腦脊液中NSE水平升高，進而使血液中NSE水平升高［29］。S100β蛋白是構成神經膠質細胞胞質的主要成分，也是一種鈣結合酸性蛋白［30-31］，其不僅反映膠質細胞功能，還可調控誘導一氧化氮合酶、炎性因子水平，影響神經元與膠質細胞的相互作用，從而調節神經細胞炎性損傷程度［32］。本研究結果顯示，重度組患者血清NSE、S100β蛋白水平低于輕度組和中度組，中度組患者血清NSE、S100β蛋白水平低于輕度組，且血清NSE、S100β蛋白水平與急性腦卒中患者MMSE評分呈負相關；提示血清NSE、S100β蛋白水平越低則急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度越重［33-35］。

本研究結果顯示，miRNA-135相對表達量評估急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的AUC為0.747，最佳截斷值為0.71；血清NPAS4水平評估急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的AUC為0.729，最佳截斷值為2.01 mg/L；血清NSE水平評估急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的AUC為0.751，最佳截斷值為13.00 U/ml；血清S100β蛋白水平評估急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度的AUC為0.755，最佳截斷值為0.19 μg/L，提示miRNA-135相對表達量及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平對急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度具有一定評估價值。

綜上所述，miRNA-34、miRNA-21與急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度無關，而miRNA-135及血清NPAS4、NSE、S100β蛋白水平與急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度有關，且四者對急性腦卒中患者認知障礙嚴重程度具有一定評估價值；但本研究樣本量較小，上述指標在急性腦卒中患者認知障礙發生發展過程中的具體作用機制等尚未明確，仍需進一步研究證實。

作者貢獻：郭萬申、李志方進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；郭萬申、李志方進行試驗實施、評估、資料收集；李志方進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。