基于Sequenom MassARRAY SNP技術檢測嗅覺受體基因與工作犬嗅探能力的關聯性研究

高一龍， 賀星亮， 強京寧， 宋珍華， 溫 海， 陶曉冉， 孫 勇， 秦海斌， 包喜軍， 孟 戈， 朱 騫

(公安部南京警犬研究所， 警犬技術公安部重點實驗室， 南京 210012)

鑒于犬的嗅覺能力突出， 目前各國警方廣泛應用訓練有素的工作犬搜查諸如爆炸物、毒品等隱匿的違禁品，打擊和預防犯罪。警犬的嗅探能力是受犬嗅覺受體(OR)基因調控的，因此如果能夠運用分子生物學技術開展警犬嗅探能力與OR 基因之間的關聯性研究工作，發現主要的分子標記來挑選嗅覺靈敏的受訓犬，可以顯著提高警犬的訓成率。

OR 是由嗅覺細胞表達的一種蛋白質，OR 基因屬于G 蛋白偶聯受體超家族[1]。1991 年， 首先在褐家鼠中發現OR 基因超家族[2]，闡明了嗅覺系統的結構組成和工作原理。OR 基因很小， 每一OR 由大約1 kb 單一編碼的外顯子組成，編碼區沒有內含子。Olender 等[3]研究識別了犬基因組中1300 個OR 基因，約占犬OR 基因組的80%。雖然目前科研人員對犬OR 基因的組成結構、分類分布和多態性等方面展開了研究，但很少有人對犬OR 基因多態性與其嗅探能力之間的關聯性進行研究。

在本研究工作中，以警用工作犬作為模式動物，采用Sequenom MassARRAY SNP 分型技術，對OR 基因的68 個SNP 位點進行分型檢測，并分析不同SNP 基因型與工作犬嗅探能力之間的關聯性，來探索驗證犬主效OR 基因SNP 位點，尋找與犬嗅探能力相關的分子標記。

1 材料與方法

1.1 動物

本研究受試對象是由113只犬組成的群體，為來自公安部南京警犬研究所實驗動物中心生產的工作犬以及各市局警犬隊的1～3 歲的史賓格犬44 只(雄24，雌20)、拉布拉多犬40 只(雄25，雌15)和德國牧羊犬29 只(雄16，雌13)。這些犬大多是經過實戰檢驗，并且通過年度復核的嗅探犬，或者是在某個特定專業方向進行訓練，處于訓練最后一個階段即實戰驗證之前的嗅探犬。所有工作犬全年飼養于戶外，一犬一舍(4 m×4 m)，犬舍屋頂有隔熱層，并有獨立的戶外運動場(15 m×6 m)。采用顆粒飼料定時定量飼喂，自由飲水，每日適度散放、運動，定時訓練。全程獸醫監控健康保障。帶犬民警和飼養管理人員，按照犬訓練使用保障條例以人道的方式對待所有受試工作犬。

1.2 主要儀器及試劑

2720 型PCR 儀購自美國ABI 公司；System electrophoresis Mupid (Mupid 2 plus)電泳槽購自日本TaKaRa公司； image system(EUV-LDUV)凝膠成像系統購自韓國 Biotech公司； Centrifuge (MICRO 17TR)離心機購自韓國Hanil公司； Agena Mass ARRAY購自美國Agena 公司。血液基因組DNA 提取試劑盒(DP348)和蛋白酶K 購自天根生化科技有限公司；PCR Enzyme 購自瑞士Roche 公司； PCR Accessory Set、SpectroCHIP Resin Kit 和IPLEX Gold Reagent Kit(Large)均購自美國Agena 公司； 濾膜(0.22 μm)購自南京天為生物科技有限公司； 引物由英濰捷基(上海)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 嗅探能力測試以及評分 本實驗研究參考文獻[4]測試方法，結合公安機關使用的警犬專業考核方法，通過警犬訓導員專業考核評分(professional test，PT)和生物本能中性測試(instinct test，IT)兩種方式，綜合考核受試犬只的嗅探能力。PT 法(百分制)是由具有豐富經驗的專業警犬訓導員，按照公安部頒發的緝毒犬、搜爆犬和血跡搜索犬考核方法和評分標準，對受試犬只的嗅探能力按百分制進行打分。IT 法(五分制)是設置與專業方向無關的食物氣味的中性測試方法，利用動物覓食的本能，考核工作犬嗅覺的靈敏性[4]。

最終結果以這2 種測試方法的加權成績得分(grading score，GS)，確定嗅探能力等級，GS 越高，則意味著該犬的嗅探能力等級越高。

加權公式： GS= PT×0.1×0.5 + IT

1.3.2 血樣采集 由具備資格獸醫，對試驗犬使用一次性真空抗凝管頸靜脈采血，每只2～5 mL，送至實驗室-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 犬基因組DNA提取與檢測 按照試劑盒說明書提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳質檢，并測定濃度和吸光度(A)值， 合格的DNA樣品， A260/A280在1.6～2.0。質檢合格的DNA 將濃度調整到50 ng/μL。

1.3.4 OR 基因SNP 的篩選 本研究根據前期預研實驗和參閱相關文獻[5，6]， 從犬OR 基因超級家族的SNP 數據庫中， 挑選出68 個SNP 位點。挑選原則：(1)具有較高多態性， 最小等位基因頻率(MAF)＞0.1；(2)考慮到OR基因SNP在犬種分布上的異質性，例如某些OR基因在某一犬種中的SNP位點數目特別多，而在另外一個犬種的SNP 位點相對較少，因此重點將文獻[5，6]中所發現的史賓格犬和拉布拉多犬這2 個犬種的OR 基因SNP 位點納入范圍(表1)。

表1 挑選的SNP 信息(部分)

1.3.5 引物設計 根據SNP 的ID 從NCBI 數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，查找所在OR 基因SNP 位點上下游100 bp 參考序列，使用Sequenom公司的引物設計軟件Assay design3.1，設計PCR反應和單堿基擴展引物并合成，引物具體序列信息見表2。

1.3.6 PCR 擴增 采用多重PCR 技術， 在384孔板中進行， 每個反應體系總體積為5 μL， 在兼容384孔板的PCR 儀上，進行擴增反應。 PCR 反應條件：95 ℃預變性2 min； 95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃60 s，共45 個循環； 72 ℃再延伸3 min。

1.3.7 PCR產物堿性磷酸酶處理 在PCR反應結束后，將配制好的SAP mix 溶液加入384 孔PCR 反應板，進行堿性磷酸酶處理反應。反應體系總體積為7 μL (PCR 產物5 μL，SAP 混合液2 μL)。堿性磷酸酶處理反應條件： 37 ℃： 40 min； 85 ℃ 5 min，4 ℃維持。

表2 SNP 引物序列信息(部分)

1.3.8 單堿基延伸 取出反應產物，將配制好的Extend mix 對應加入384 孔反應板。對于每個反應孔，單堿基延伸反應體系包含SAP 處理后PCR 產物7 μL 及 Extend Mix 液2 μL，總體系9 μL。啟動PCR 儀進行單堿基延伸反應。單堿基延伸PCR反應條件： 94 ℃預變性30 s；94 ℃ 5 s，(52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，5 個內循環)，再一起40 個外循環；72 ℃再延伸3 min。

1.3.9 樹脂純化 將反應產物加16 μL水進行稀釋，稀釋后使用樹脂進行脫鹽。

1.3.10 芯片點樣 沉淀樹脂后使用MassARRAY Nanodispenser RS1000 點樣儀轉移至384 孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，自然結晶。

1.3.11 質譜檢測 上機進行MALDI-TOF 質譜檢測，并收集數據，采用TYPER4.0 軟件(Sequenom)進行基因型判讀。

1.4 關聯分析

關聯分析中， 質控主要是評價樣本及 SNP 位點性能的操作， 通過質控剔除不符合條件的樣本或 SNP位點可有效降低關聯假陽性的概率。樣本的質控主要包括： 樣本群體結構、雜合度等； SNP 位點的質控主要包括： call rate(檢出率)、哈迪溫伯格(H-W)平衡檢驗、最小等位基因頻率等。

采用 plink 軟件進行統計分析， 用線性回歸模型， 對所有合格樣品SNP與對應的工作犬考核評分，進行嗅探能力關聯分析： 分析嗅覺靈敏個體(GS 高分)和嗅覺遲鈍個體(GS 低分)在每個SNP 位點上基因型和等位基因的差異，尋找與工作犬嗅探能力顯著相關的SNP 位點。

多重檢驗校正一般采用bonferroni (BONF)校正法，校正的方法是P*位點數。比如我們一共做了20 個位點，校正后的BONF 值為P*20，結果仍然＜0.05，這是可以判定為顯著，＜0.01 則為極顯著。BONF 校正方法檢驗過于嚴格，導致找不到顯著差異的基因位點(假陰性)。而FDR_BH 法，是用一種簡單好用且比較溫和的方法校正P值，可以在假陽性和假陰性間達到平衡，將假/真陽性比例控制到一定范圍之內。FDR(假陽性率)錯誤控制法基本原理是通過控制FDR值來決定P值的值域。那么怎么從P 值來估算FDR 呢，人們設計了幾種不同的估算模型，其中使用最多的是Benjamini and Hochberg 方法，簡稱BH 法。

因此，本研究對關聯分析結果的P 值，采取了BONF 法和BH 法進行多重檢驗校正。

2 結果

2.1 工作犬嗅探能力考核評分

嗅探能力綜合考核評分結果見表3。

2.2 SNP 位點檢測分型

2.2.1 SNP 位點檢出率 68 個SNP 位點檢出率，數據結果見表4。

表3 工作犬嗅探能力考評得分情況(部分)

表4 SNP 位點檢出率(部分)

2.2.2 SNP位點基因分型結果 受試的113只工作犬， 在各個OR 基因的SNP位點上，均能有效分型。

2.3 關聯分析結果

2.3.1 最小等位基因頻率及H-W平衡檢驗 對所研究的群體進行卡方檢驗，P＞0.05，說明接受零假設， 即群體滿足H-W 平衡， 反之， 如果P＜0.05， 說明群體不滿足H-W 平衡。68 個SNP 位點經質控后合格的有52 個(P＞0.05)，說明采樣的犬群滿足H-W平衡，可以進行關聯性分析研究(表5)。

2.3.2 關聯分析結果 有23 個SNP 位點與工作犬的嗅探能力有統計學意義上的顯著相關(P＜0.05)，其余29 個SNP 位點的基因型與工作犬嗅探能力顯著不相關(P＞0.05)，工作犬嗅探能力關聯分析情況詳見表6。

經過多重檢驗BONF法校正后， COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4個SNP位點與嗅探能力顯著相關(P＜0.05)； 經過多重檢驗FDR_BH 法校正后，COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4 個SNP 位點與嗅探能力極顯著相關(P＜0.01)。

3 討論

3.1 檢測方法的建立

本實驗研究通過應用設計軟件Assay design3.1，設計PCR 反應和單堿基擴展引物，對引物濃度、堿性磷酸酶處理反應液(SAP Mix)、單堿基延伸反應液(EXTEND Mix)退火溫度、模板量等進行優化，成功篩選出68 組特異性好、靈敏度更高的引物， 結果表明， 建立的Sequenom MassARRAY SNP檢測OR 基因分型技術方法， 68 個SNP 位點在在史賓格犬、拉布拉多犬和德國牧羊犬3 個犬種中檢出率在90%以上，說明該方法可以有效應用于這3個犬種的OR 基因SNP 分型。

3.2 關聯分析結果校正

本研究對關聯分析結果的P值，采取了BONF法和BH 法進行了多重檢驗校正，均發現有同樣的4 個SNP位點與嗅探能力相關，只是顯著程度有所區別，說明COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4 個SNP位點，可以作為建立嗅探能力分子檢測方法的首選位點。

3.3 OR 基因與犬嗅探能力的研究

Anna 等[4]曾挑選了5 個OR 基因， 試圖探究OR基因與警犬嗅探能力之間的關系， 結果檢測到18個SNPs， 其中cOR52N9_176 和cOR9S13_592 這2 個基因顯著影響嗅探犬的檢測能力。 Yang等[7]曾應用Beckman Genome-Lab SNP stream 技術，選擇了OR 基因的22 個SNP 位點，試圖探究其與德國牧羊犬嗅探能力之間的關系， 結果顯示，OR10H1-like 632C＞T、OR10H1-like 770A＞T、OR2K2-like 518G＞A、 OR4C11-like 511T＞G 和OR4C11-like 692G＞A 這5 個SNP 位點可能極顯著影響德國牧羊犬嗅探能力。

表5 基因頻率及H-W 平衡檢驗情況(部分)

表6 工作犬嗅探能力關聯分析情況(部分)

而本研究篩選了OR基因的68個SNP位點，應用Sequenom MassARRAY SNP 技術對史賓格犬、拉布拉多犬和德國牧羊犬這3個品種工作犬OR基因的SNP 位點進行基因分型檢測，發現與工作犬的嗅探能力呈一般統計學意義上的顯著相關(P＜0.05)的SNP位點有23個， 其中經過多重檢驗校正后，發現COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364和CfOR0055_265 這4 個SNP 位點與這3 個品種工作犬嗅探能力顯著相關，這4 個SNP位點是國內外首次發現。本研究較Anna 等[4]和Yang 等[7]研究篩選的SNP 數量更多，發現的與工作犬嗅探能力顯著相關的SNP 位點適應的品種更為豐富，為工作犬嗅探能力相關基因的輔助育種提供了候選標記。

綜上所述， 本研究篩選出與工作犬嗅探氣味能力相關聯的主效OR 基因SNP 位點4 個， 初步建立了一種能適用于鑒定史賓格犬、拉布拉多犬和德國牧羊犬等3個工作犬種嗅探能力的分子遺傳學檢測方法。該方法可應用于選種選育， 促進精準育種； 也可以用于選擇嗅探能力優秀的合格受訓犬， 節省人力物力和訓練時間， 提升警犬訓練和實戰使用的效果。