胍鹽聚合物添加量對抗菌食品包裝膜抗菌性及物理性能的影響

汪 敏，趙永富※，謝洪德，金浴雅，黃 倩

（1. 農業部長江中下游設施農業工程重點實驗室，江蘇省農業科學院農業設施與裝備研究所，南京 210014；2. 蘇州大學材料工程學院，蘇州 215021；3. 南京農業大學食品科技學院，南京 210095）

0 引 言

抗菌材料作為一種新興的材料，能有效的抑制細菌的生長與繁殖，越來越受到人們的關注，抗菌材料的開發及應用在國內外有良好的發展前景。在眾多抗菌劑產品中，胍類抗菌劑具有殺傷力強、毒性小、性能穩定等優點[1-2]。聚六亞甲基胍類抗菌劑分為單胍鹽和雙胍鹽，其中雙胍鹽更溫和，安全性更高，而鹽酸鹽又比其他鹽類殺菌效果更好[3-4]。聚六亞甲基鹽酸鹽被認定為陽離子殺菌劑中抗菌效果最好的抗菌藥，其性狀為白色無定形粉末，沒有特殊氣味，不揮發，對各類表面處理無腐蝕，環境友好[5]。聚六亞甲基胍鹽抗菌劑具有優越的殺菌活性，其優越性主要體現在：高效、安全、無毒副作用，對光、熱穩定，不產生細菌耐藥性，持久有效[6-7]。

胍鹽及其衍生物被引入到高聚物結構中，所得到的胍鹽聚合物具有較強抗菌性[8-9]。Zhang等[10]通過縮聚合成的胍鹽，具有較好的抗細菌和真菌的效果。Guan等[11]制得含有抗菌胍鹽基團的紙漿纖維，測試其對埃希氏桿菌的抗菌活性很高。Qian等[12]制備的胍鹽聚合物最小抑菌濃度僅為8 mg/L，具有極強抗菌力。李旭等[13]將制備的胍鹽抗菌劑添加到紙張中，提供了抗菌性能和增濕強效果。胍鹽聚合物常見應用于紡織、醫療和其他日常用品的殺菌消毒，將抗菌胍鹽添加于最常見的PE薄膜制備抗菌薄膜材料尚未見報道。

在食品保鮮中，相比于直接浸泡和噴灑抗菌劑，將抗菌劑添加至薄膜材料中，可以避免由于食品化學組分影響而降低抗菌劑的抗菌活性[14]。因此，在抗菌薄膜材料的研制中，可以利用聚合物的復合穩定作用，將PHMB母粒分散在聚乙烯基體中制得PHMB抗菌膜。如何制備出既具有強抗菌性能又能保持其他綜合性能優良的PHMB抗菌膜，成為亟待解決的問題。本研究以不同PHMB母粒添加量的抗菌膜為研究對象，探究不同PHMB母粒添加量對薄膜的抗菌性，以及透光率、水蒸氣透過率、力學性能等性能的影響，以期為抗菌材料的研制提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

低密度聚乙烯（low density polyethylene，LDPE）、高密度聚乙烯（high density polyethylene，HDPE），上海奉納塑化有限公司生產；聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽（polyhexamethylene biguanidine hydrochloride，PHMB）購自常州凱喬生物科技有限公司；大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC6538均購自美國標準物質保藏中心。

PHMB抗菌母粒、抗菌薄膜均在蘇州德捷膜材料科技有限公司進行加工。

1.2 PHMB抗菌薄膜的制備

1.2.1 PHMB抗菌母粒制備流程

HDPE/LDPE（1:4）基體樹脂→添加PHMB→密煉→雙螺桿擠出機→共混擠出造粒。

1.2.2 PHMB抗菌薄膜的制備

將PHMB抗菌母粒以0、2%、3%、4%、5%、6%、7%質量比(由預試驗確定)添加到HDPE/LDPE=1∶4樹脂中，混合均勻，吹膜。工藝條件：吹膜溫度分別為145、155、165、175、185 ℃，擠出模頭溫度為 195 ℃，轉速為30 r/min。制得抗菌母粒質量分數分別為0、2%、3%、4%、5%、6%、7%的聚乙烯薄膜。

1.3 PHMB抗菌薄膜的抗菌性測試

1.3.1 抗菌性能測試

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液制備：用接種環取斜面培養菌種，于瓊脂培養基上進行平板劃線，37 ℃溫度下培養24 h，活化完成。用接種環取活化后的菌種，用生理鹽水依次配10倍遞增稀釋液。

雜菌菌懸液樣品制備：以未經消毒清洗的青菜為供試樣品。從田間采摘新鮮青菜(品種為上海青 )，立即剪碎，與生理鹽水按質量比1∶1混合，研磨，用紗布過濾至燒杯中，用生理鹽水依次做10倍遞增稀釋液。

將薄膜樣品裁剪為50 mm×50 mm大小，參照標準GB/T 31402-2015[15]方法，通過貼膜法將菌液與薄膜樣品進行24 h充分接觸后，進行菌落培養與計數，測定薄膜的抗菌性能。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別用對應的3M片進行計數測定。菌落總數用營養瓊脂培養基進行培養測定，瓊脂培養基由本實驗室配制。

按下式計算薄膜的抗菌率。

式中R為抗菌率，%；B為空白對照樣品平均回收菌數，cfu/片；C為抗菌樣品平均回收菌數，CFU/片。

1.3.2 抗菌長效性檢測

取3組抗菌膜樣品、3組對照樣品置于試驗室臺上，自然條件下儲存，分別于1個月、3個月、6個月時測試抗菌率，方法同1.3.1中介紹的貼膜法。同時測定該期間的最高和最低溫度。

1.4 PHMB母粒添加量對薄膜性能的影響

1.4.1 透光率

參照ASTM D1746-2015方法，將薄膜剪成9 mm×30 mm的大小，夾持于紫外可見分光光度計（UV-3200PC，上海美譜達儀器有限公司）的樣品吸收池，使入射光束垂直通過膜材料，在560 nm的波長處進行掃描，測定透光率。不放薄膜時透光率為100%作為對照，每個樣品平行測3組。

1.4.2 水蒸氣透過率

參照 ASTM E96/E96M-2013和 GB 1037-1988[16]方法，將粒度為2 mm的無水CaCl2放入平口量杯中，至杯口3 mm處為止。然后將薄膜樣品水平緊密固定于杯口，稱質量后將量杯放入38 ℃，相對濕度90%的恒溫恒濕箱，每隔一定時間，稱量量杯的質量。每個樣品平行測3組。按式（2）計算薄膜水蒸氣透過率。

式中WVTR為水蒸氣透過率，g/(m2·d)；Δm為t時間內的質量增加，g；S為試樣透水蒸氣的面積，m2；Δt為質量增量穩定后的2次時間間隔，h。

1.4.3 力學性能

將抗菌膜制備為主軸分別平行和垂直于薄膜取向方向的 2組試樣，分別為樣品的橫向和縱向取樣。樣品尺寸為長150 mm、寬20 mm的矩形。斷裂拉伸強度及斷裂伸長率采用微機控制電子萬能材料試驗機（HY-0580，上海衡翼精密儀器有限公司）進行測量。測試條件：室溫25 ℃，拉伸速度為300 mm/min，夾具間距為100 mm，每個樣品平行測10組。

1.5 PHMB抗菌膜的保鮮試驗

以未經滅菌處理的鱈魚干片為試樣，分別用普通PE膜和PHMB（4%）抗菌膜進行包裝，存放7 d后，從與包裝袋直接觸的鱈魚干片表層取樣檢測菌落總數、大腸菌群和金黃色葡萄球菌負載量。

2 結果與分析

2.1 PHMB母粒添加量對抗菌性的影響

2.1.1 大腸桿菌抑菌試驗

圖1為PHMB抗菌膜對大腸桿菌的抗菌效果，圖2是抗菌膜中 PHMB母粒添加量與抗菌率(大腸桿菌)的關系曲線。由圖1可以看出，檢測空白樣(圖1a)和對照膜(圖1b，PHMB母粒添加量為0)所用的3M大腸桿菌快速測試片的培養基底色為紫色，菌落為藍色且呈現散點狀密集分布。當在聚乙烯膜基材中添加PHMB母粒制成抗菌膜后，對應的3M快速測試片的培養基底色為紫紅色，菌落為暗紅色且菌落數依次減少，直至完全消失（圖1g、1h）。這是因為抗菌膜上負載的大腸桿菌被殺死或生長受到抑制，從抗菌膜上洗脫下來的大腸桿菌活菌數逐漸減少的緣故。圖2定量表示了抗菌膜中PHMB母粒添加量對抗菌性能即抗菌率的影響。當PHMB母粒添加量為2%、3%時，薄膜的抗菌率分別為 72.5%、85.2%。而當PHMB母粒添加量為4%時，檢測到的菌落平均數為3個，薄膜抗菌率為99.1%。當PHMB母粒添加量為5%以上時，抗菌率達到99.7%。制備的抗菌膜基本抑制大腸桿菌的生長。

Nikkola等[17]利用胍鹽（polyhexamethylene guanide hydrochloride ，PHMG）修飾聚乙烯醇，然后接枝到聚酰胺膜上。隨著混合溶液中PHMG比例的增加，所制得的改性膜對大腸桿菌的抗菌性能相應增加。Li等[18]將胍鹽與均苯三甲酰氯進行界面聚合反應制得復合納濾膜，當用質量分數為2%時，對大腸桿菌殺菌率達100%。本試驗將PHMB與聚乙烯進行共混密煉，制得的膜產品對大腸桿菌抗菌作用與上述研究結果一致。聚六亞甲基胍鹽中的胍基具有較高的活性，聚合物成正電性。由于各類細菌、病毒一般呈負電性，所以很容易發生相互吸附作用，進而使細菌、病毒無法分裂繁殖，喪失活性[19]。隨著PHMB母粒添加量的增加，抗菌膜中胍基含量增大，更多具有殺菌性能的胍基暴露到膜表面，導致薄膜與大腸桿菌接觸機會增大，殺菌性能隨之提高[20]。

圖1 PHMB抗菌膜對大腸桿菌的抗菌效果Fig.1 Antibacterial effect of PHMB antibacterial film on Escherichia coli

圖2 抗菌膜中PHMB母粒添加量與抗菌率(大腸桿菌)的關系Fig.2 Relationship between amount of PHMB masterbatch in antibacterial film and antibacterial rate (E. coli)

2.1.2 金黃色葡萄球菌抑菌試驗

圖3為PHMB抗菌膜對金黃色葡萄球菌的抗菌效果，圖4是抗菌膜中PHMB母粒添加量與抗菌率（金黃色葡萄球菌）的關系曲線。觀察圖3，檢測空白樣（圖3a）和對照膜(圖3b，PHMB母粒添加量為0)所用的3M金黃色葡萄球菌快速測試片的培養基底色為淡黃色，菌落為紫色且呈簇狀密集分布。當添加PHMB母粒制成抗菌膜后，雖然對應的3M快速測試片的培養基底色變化不大，但簇狀菌落減小（圖3e、3f），最終消失（圖3g、3h）。說明抗菌膜上接種的金黃色葡萄球菌被PHMB殺死或生長受到抑制。由圖4曲線可得，當PHMB母粒添加量為2%、3%和 4%時，薄膜抗金黃色葡萄球菌的比率分別為60.3%、72.6%和99.2%。當PHMB母粒添加量為5%以上時，抗菌率趨近100.0%。

已有研究表明，胍基聚合物對革蘭氏陽性菌、陰性菌具有類似的殺菌效率[21-22]。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌。本試驗結果表明，當抗菌膜中PHMB母粒添加量達到4%時，PHMB抗菌膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率均達到 95%以上。這是由胍類聚合物靜電殺菌的共同機理所決定的[23]。可能的解釋是：PHMB薄膜的殺菌效率或最低抑制濃度主要取決于其膜表面的陽電荷密度分布，其次才是細菌的類別。

圖3 PHMB抗菌膜對金黃色葡萄球菌的抗菌效果Fig.3 Antibacterial effect of PHMB antibacterial film on Staphylococcus aureus

圖4 抗菌膜中PHMB母粒添加量與抗菌率（金黃色葡萄球菌）的關系Fig.4 Relationship between amount of PHMB masterbatch in antibacterial film and antibacterial rate (Staphylococcus aureus)

2.1.3 雜菌抑菌試驗

為了考察 PHMB抗菌膜對多種細菌的共同抑菌作用，采摘新鮮青菜（品種為上海青）以獲取雜菌樣品并進行抗菌試驗。圖5為PHMB抗菌膜對雜菌樣品的抗菌效果，圖6是抗菌膜中PHMB母粒添加量與抗菌率（雜菌）的關系曲線。雜菌數量檢驗采用活菌計數法(培養法)。由圖5可見，與空白樣相比，隨著PHMB母粒添加量的增加，培養皿中的菌落由密集交叉變成疏離可分，當PHMB母粒添加量為4%以后，菌落總數小于10個。從圖6的抗菌曲線看，抗菌膜的抗菌率隨PHMB母粒添加量增多而逐漸增大。當PHMB母粒添加量為4%、5%時，抗菌率分別為 83.4%和 89.4%，具備較強的抗菌性；當PHMB母粒添加量為6%、7%時，抗菌率大于90%。

從田間采摘的新鮮青菜受土壤、肥料和水質污染，可能存有大量的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、放線菌、霉菌和酵母菌等[24]。相對于菠菜、芹菜等其他葉菜，青菜可培養的細菌菌落數最高[25]。PHMB抗菌膜對青菜液中多種雜菌（需氧菌等）生長都具有抑制效果，說明PHMB抗菌膜具有廣譜殺菌性。這是因為PHMB是陽離子聚合物，其殺菌方式是通過非特異性相互作用來實現的[26]。而PHMB抗菌膜對雜菌殺菌效率比大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液低10%以上，可能原因是：聚胍物在低濃度時，雖有細胞內組分滲出，但細菌的形態完整；只有當濃度大于最低抑菌濃度時，細菌細胞才破解成碎片而致死。

圖5 PHMB抗菌膜對菌落總數的抗菌效果Fig.5 Antibacterial effect of PHMB antibacterial film on total number of colonies

圖6 PHMB抗菌膜對菌落總數的抗菌率Fig.6 Antibacterial rate of PHMB antibacterial film to total number of colonies

2.1.4 PHMB抗菌薄膜的抗菌長效性

以PHMB母粒添加量為4%的抗菌膜為試樣，進行儲藏試驗，測試不同貯藏時間下的抗菌率變化，見圖 7和圖8。結果表明，存放1個月、3個月和6個月后，PHMB抗菌膜(4%)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率略微下降，但都高于96.9%。在6個月試驗過程中，南京最高氣溫40 ℃，最低氣溫為-8 ℃，此為近10 a來南方地區氣溫變動的最大范圍。這說明PHMB抗菌性能持久、穩定，受溫度影響小。推測在自然溫度條件下，抗菌膜的功能基團很少發生遷移或膜表面靜電吸附性能變化不大。

圖7 PHMB抗菌膜抗大腸桿菌長效性Fig.7 PHMB antibacterial film for long-term resistance to Escherichia coli

圖8 PHMB抗菌膜抗金黃色葡萄球菌長效性Fig.8 PHMB antibacterial film for long-term resistance to Staphylococcus aureus

2.2 PHMB母粒添加量對薄膜使用特性的影響

2.2.1 透光率

作為食品包裝材料，透光率過大會帶來光照對食品品質的損壞，透光率過小薄膜表現為渾濁也影響包裝品質。圖9為抗菌膜中PHMB母粒添加量與透光率的關系曲線。由圖可知，隨著PHMB母粒添加量增大，抗菌膜的透光率逐漸升高，隨后略微下降，但總體變化很小。未添加PHMB母粒的對照膜在560 nm波長下透光率為86.9%，PHMB母粒添加量為5%的抗菌膜透光率最高，達89.1%。高添加量（5%、6%、7%）比低添加量（2%、3%、4%）的 PHMB抗菌膜的透光率值波動大。這可能是因為，胍鹽粉末結晶度低[27]、顆粒粒徑小，填充到聚乙烯結構的孔隙中可以減少光的折射，膜的透光性能增加[28]。但當添加量增大后，團聚作用在體系內部的粒子造成光的漫反射現象變大，故造成薄膜的透光率降低，且薄膜不同微區的透光率差異增大。

圖9 PHMB母粒添加量對抗菌膜透光率的影響Fig.9 Transmittance of antibacterial film with different PHMB addition amount

2.2.2 水蒸氣透過率

薄膜水蒸氣透過率能夠反映薄膜對水分的阻隔效果。圖10為抗菌膜中PHMB母粒添加量與水蒸氣透過率的關系曲線。添加PHMB母粒后，抗菌膜水蒸氣透過率總體呈現升高趨勢，但增加不大。當PHMB母粒的添加量由0增至3%后，抗菌膜水蒸氣透過率從28.86 g/(m2·d)升至 35.25 g/(m2·d)，隨后趨于平緩。這可能是，因為帶有極性的胍基基團存在于聚乙烯的三維結構之間，構成微細的水分子通道，有利于水汽的透過。但當PHMB母粒添加量不斷增大后，由于異相成核作用，在一定程度上減弱了聚乙烯分子間的緊密排列，又對水分子的通過有一定的阻礙作用[29]。

圖10 PHMB母粒添加量對抗菌膜水蒸氣透過率的影響Fig10 Effects of different PHMB contents on water vapor permeability of antibacterial films

在食品保藏中，濕度過高容易促發物性變化，如受潮結晶、結塊或失去脆性等，同時會促使微生物繁殖、油脂氧化、褐變和色素氧化。聚乙烯作為阻濕防潮包裝材料，可以控制包裝食品因脫水或吸濕而變色。添加PHMB母粒后，薄膜透濕率變化不大，仍然保持較低的透濕率，有利于食品的貯藏保鮮。

2.2.3 力學性能

食品包裝材料需要有一定的強度，來抵抗運輸中的破壞力。力學性能是反映包裝材料這一基本使用的指標。圖11顯示抗菌膜中PHMB母粒添加量與拉伸強度和斷裂伸長率的關系。由圖11可知，在拉伸強度方面：PHMB母粒添加量為4%時，抗菌膜的橫向拉伸強度達到最大值16.6 MPa，相比對照膜提高了 19.1%；但隨著 PHMB母粒添加量繼續增大，抗菌膜拉伸強度有所降低，但也高于對照膜。縱向方向PHMB抗菌膜的拉伸強度與橫向方向上的變化趨勢一致。在PHMB母粒添加量為4%時，抗菌膜縱向拉伸強度達到最大值18.5 MPa，相比對照膜提高了18.4%。斷裂伸長率方面：橫縱2個方向，抗菌膜的斷裂伸長率均隨PHMB母粒添加量的增大呈先增大后減小的趨勢，但都高于對照膜。當PHMB母粒添加量為4%時，兩者都達到最大值。總之，PHMB可以明顯提高聚乙烯膜的力學性能。

有學者發現，添加竹粉[30]或者丙烯酸酯增容劑[31]均能將聚乙烯的拉升強度提高至17MPa左右。潘明珠等[32]將聚磷酸銨添加至秸稈-高密度聚乙烯，發現復合材料的斷裂伸長率和沖擊強度先增加后下降。在PHMB抗菌膜中，PHMB顆粒與聚乙烯基體之間存在一層由基體分子鏈吸附在胍鹽顆粒表面構成的界面層[33]，PHMB顆粒和聚乙烯分子鏈通過界面層的作用，連接在一起形成了三維網狀結構，其中PHMB顆粒起到了交聯點的作用。材料受到拉伸應力作用時，交聯點可以起到均勻分布應力的作用，減少了整體的破壞。因此，應力的分散作用是使得低PHMB母粒添加量時抗菌膜拉伸強度提高的主要原因。當PHMB母粒添加量增大時，由于界面缺陷增多導致界面強度降低及弱聚集體數目的增加，PHMB的拉伸強度反而降低。

圖11 PHMB抗菌膜橫縱方向的拉伸強度和斷裂伸長率Fig.11 Tensile strength and elongation at break of PHMB antibacterial film in longitudinal and vertical directions

2.3 PHMB抗菌膜對鱈魚干微生物生長的抑制作用

以未經消毒滅菌處理的鱈魚干樣品為試樣，進行PHMB抗菌膜對實際樣品抗菌試驗。經檢驗，鱈魚干樣品的初始菌落總數為 7.1×105CFU/g，大腸菌群為 1.5×104MPN/kg，金黃色葡萄球菌為 7.5×102CFU/g。如表 1所示，普通PE薄膜包裝的鱈魚干存放7 d后，其表層菌落總數、大腸菌群和金黃色葡萄球菌活菌數分別增到2.7×106CFU/g、4.6×104MPN/kg和 1.4×103CFU/g。而采用PHMB（4%）抗菌膜包裝的鱈魚干，存放同樣時間后，其表層菌落總數、大腸菌群和金黃色葡萄球菌活菌數則分別降低為 5.2×104CFU/g、3.0×102MPN/kg和 5.8×102CFU/g。

一般來說，食品表層直接與加工設備、空氣、水氣及生產者手部接觸，污染幾率較大[34]。采用PHMB抗菌膜包裝食品，可以有效地抑制食品與包裝接觸面層的微生物生長，從而降低預處理或后續輻照[35]、微波等殺菌時間，減少加工費用，達到延長食品保質期的目標。

表1 PHMB抗菌膜對鱈魚干（存放7 d）的抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of PHMB antibacterial film on dried squid (stored for 7 d)

3 結 論

胍基聚合物是一種陽離子型殺菌劑，而細菌細胞膜外呈負電性，所以胍基通過與細菌細胞靜電吸附作用，導致細胞膜破裂，殺死各類細菌、真菌。本研究將自制的PHMB母粒添加至聚乙烯基體中，在一定的工藝條件下制得PHMB抗菌膜。該抗菌膜在PHMB母粒添加量為0～7%范圍內時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和雜菌均具有強抗菌作用，且隨著添加量的增加抗菌效應加大。當PHMB母粒添加量為4%時，抗菌膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抗菌效率接近100%，且存放6個月后的抗菌效率仍維持在96.9%；對雜菌樣品的抗菌率比大腸桿菌、金黃色葡萄球菌低。為進一步地驗證PHMB薄膜對實際食品的抗菌性，采用該膜包裝鱈魚干，有效地控制食品接觸層內的微生物生長。這說明制備的PHMB抗菌膜具有高效、廣譜、持久地殺菌抗菌效果。

PHMB膜作為包裝材料，必須具備一定的物理性能。上述對PHMB薄膜的測試結果表明，在PHMB母粒添加量為 0～7%范圍內，薄膜透光率、水蒸氣透過率基本不受影響，但力學性能以PHMB母粒添加量為4%時最優。

綜合上述可以得出結論：在本試驗設定聚乙烯、PHMB配方、母粒加工和吹膜工藝條件下，從PHMB膜的抗菌性和物理性能出發，PHMB母粒最適宜添加量為4%。本PHMB薄膜對雜菌樣品的抗菌率明顯降低，其與抗菌膜微觀結構有什么關聯，工藝怎樣改進才能提高抗菌率還有待進一步探討。