酒花浸膏關鍵性香氣成分分析

王 娟，李 娟，夏艷秋，黃明泉，張璟琳*，孫寶國，張玉玉

（北京工商大學，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，食品質量與安全北京實驗室，北京市風味化學重點實驗室，北京 100048）

酒花又稱啤酒花，是藥食同源植物，屬大麻科葎草屬。我國人工栽培酒花已有五十多年，主要分布于新疆、河北、陜西、四川等地[1]。酒花浸膏是以天然酒花或酒花顆粒為原料，經微波輔助浸提、超臨界二氧化碳萃取等方法得到的具有啤酒花香氣的金黃色黏稠液體[2-3]。酒花浸膏藥用價值與獨特的天然香氣特征使其在醫藥、食品、煙草等領域具有廣闊的前景和研究價值。國內外對于酒花和酒花浸膏的研究工作主要集中于生產工藝、化學成分的分析、毒理學的研究以及α-酸的測定等方面[4-6]。α-酸是多種結構類似物的混合物，按其側鏈的不同，α-酸有5 個同系物：葎草酮、輔葎草酮、加葎草酮、前葎草酮和后葎草酮[6]。中國藥典記載酒花的乙醇浸膏可用于治療肺結核病和麻風病等癥[7-8]。Bland等[9]研究表明酒花浸膏中的異葎草酮可改善胰島素抵抗和血脂異常，同時也可以減少全身性炎癥，增加脂肪代謝和降低高脂喂養動物模型中的肥胖。Praet等[10]利用啤酒花提取物作為發酵面包的抗真菌原料。二氧化碳酒花浸膏、異構化浸膏、四氫異構化浸膏的應用，大大改善啤酒花在啤酒釀造中的利用效率，且其中的萜類物質在啤酒發酵過程中通過生物和化學變化生成的其他物質，能極大地影響啤酒的香氣類型和強度[11]。

關于酒花中揮發性成分的研究已有一些相關文獻報道[12-18]，如Aberl等[12]研究出酒花中酒花油的揮發性成分多達400多種，其主要成分為石竹烯、蛇麻烯及月桂烯。陶鑫涼等[15]通過固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）結合氣相色譜-質譜方法定量分析啤酒花中19 種香氣成分，19 種化合物回收率為81.2%～116.8%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于9.8%，該方法具有操作簡便、樣品用量少、靈敏度高等優點。王輝[16]研究酒花品種、新鮮度、配方和工藝對啤酒風味的影響，表明新鮮酒花所釀啤酒風味保鮮期更長。Inui等[17]采用全二維氣相色譜-飛行時間質譜（two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC×GC/MS-TOF）聯用儀對不同種類酒花進行分析，共得到67 種與酒花風味有明顯相關性的化合物。王露等[13]采用同時蒸餾萃取（simultaneous distillation and extraction，SDE）、SPME、水蒸氣蒸餾（steam distillation，SD）3 種前處理方法結合氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatographyolfactory-mass spectrometry，GC-O-MS）聯用對酒花中香氣活性成分進行分析，結果表明SPME法最適合酒花中香氣活性成分的萃取，并采用該法對酒花進行GC-O-MS檢測，嗅聞得到的重要活性成分有香葉醇、橙花醇、乙酸香葉酯、辛酸甲酯、橙花叔醇、β-石竹烯等。而關于酒花浸膏的香氣活性成分分析鮮有報道。

本研究系統分析酒花浸膏中的關鍵性香氣成分，首先采用SPME與溶劑輔助蒸發萃取（solvent-assisted flavor evaporative，SAFE）兩種前處理方法分別對酒花浸膏進行GC-MS分析，并結合雙色譜柱定性其揮發性成分；再通過GC-O結合香氣提取稀釋分析（aroma extraction dilution analysis，AEDA）找出香氣活性物質；然后，對風味稀釋（flavor dilution，FD）因子較大的進行定量分析，計算其香氣活性值（odor activity value，OAV）；最后，綜合AEDA和OAV結果確定酒花浸膏的關鍵性風味化合物。本研究有助于揭示酒花浸膏中香味成分的化學本質，可為其質量標準的修訂和完善提供參考數據，促進其在香精香料中的進一步應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒花浸膏（乙醇浸提，批號20140223，含水量3.64%，水溶物含量230 mg/g，醇溶物含量750 mg/g）杭州西湖香精香料有限公司；乙醚（重蒸）、正戊烷（重蒸）、無水硫酸鈉、無水乙醇（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

異戊酸己酯（內標）、正構烷烴（C6～C30）、乙酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、戊酸乙酯、異己酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、戊二酸二乙酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、鄰氨基苯甲酸甲酯、(E)-4-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、DL-2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、亞麻酸乙酯、乙醇、異戊烯醇、苯甲醇、丙酮、2-十一酮、2-十二酮、2-十三酮、異丁酸、異戊酸、己酸、(E)-石竹烯、十三烷、2-乙酰基吡咯（均為色譜純，純度＞95%） 百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

T-403電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；EF9697 Pipetman M精密移液器 法國Gilson公司；TRACE ULTRA-DSQII和TRACE1310-ISQ LT GC-MS聯用儀 美國Thermo Fisher公司；ODP3嗅聞檢測儀 德國Gerstel公司；SPME進樣手柄、SPME萃取頭（灰色）50/30 μm DVB/CAR/PDMS 美國Supelco公司；BF-2000氮氣吹干儀 北京八方世紀科技有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 SPME

將50/30 μm灰色萃取頭（DVB/CAR/PDMS）在GC進樣口老化時間30 min，老化溫度250 ℃。稱取（1.000±0.002）g樣品置于20 mL樣品瓶中，在50 ℃水浴鍋中平衡30 min，插入活化好的萃取頭頂空萃取50 min，拔出萃取頭插入到GC-MS聯機的進樣口，在250 ℃解吸3.0 min[19]。

1.3.1.2 SAFE

稱取（2.000±0.002）g樣品浸膏置于錐形瓶中，加入質量濃度為4.27 mg/mL的異戊酸己酯250 μL作為內標，再加入200 mL體積比為1∶1的乙醚和正戊烷混合溶液，超聲30 min，經過濾去除不溶物得到萃取液。將該萃取液置于SAFE裝置的滴液漏斗中，并在冷阱中加入液氮，將循環水和水浴的水溫設為40 ℃，當系統真空度達到1×10-6MPa時，緩慢打開滴液漏斗旋塞，在萃取過程中保持樣品勻速滴下[20]。萃取完后，向萃取液中加入無水硫酸鈉置于4 ℃冰箱中12 h，過濾后通過旋轉蒸發儀濃縮至2.0 mL，待GC-MS分析。以上實驗重復3 次。

1.3.2 GC-MS分析

GC條件：TRACE1310-ISQ LT：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初溫40 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，保持10 min；再以6 ℃/min升至150 ℃，保持8 min；最后以20 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。載氣He，純度99.999%，流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；分流比100∶1（SPME法：無溶劑延遲；SAFE法：進樣量1.0 μL，溶劑延遲3.0 min）。TRACE ULTRA-DSQII：TG-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初溫40 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，保持5 min；再以4 ℃/min升至130 ℃，保持10 min；再以20 ℃/min升至230 ℃，保持20 min；其他條件同上。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度280 ℃，質量掃描范圍m/z 35～450，全掃描。

GC-MS條件：GC與TRACE1310-ISQ LT MS條件相同；進樣量1.0 μL，樣品經進樣口解吸后，經GC色譜柱分離后，分別進入火焰離子檢測器和嗅聞檢測器，分流比為1∶1；嗅聞儀條件：接口溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃，氮氣輸出流量15 mL/min。

1.3.3 化合物鑒定

1.3.3.1 定性分析

采用NIST14譜庫檢索、標準品比對，并結合保留指數（retention index，RI）進行定性。

RI定性：在相同色譜條件下，分別將樣品與正構烷烴（C6～C30）前后進樣進行分析，通過計算公式（1）計算RI，并與文獻中報道的RI對比，將絕對值相差10以內的確定為同一化合物。

式中：n和n+1分別為未知化合物流出前后正構烷烴碳原子數；t為未知化合物保留時間；tn和tn+1為相應正構烷烴的保留時間（tn＜t＜tn+1）。

1.3.3.2 GC-O/AEDA分析

采用GC-O結合AEDA對酒花浸膏中的香氣活性成分進行分析。將樣品經SAFE濃縮液用乙醚和正戊烷1∶1的混合液按照3n逐級進行稀釋，取稀釋后濃縮液1 μL進GC-O分析，3 位評價人員記錄在嗅聞口所聞到的香味特征和保留時間，直到嗅聞評價人員在嗅聞端嗅聞不到氣味。FD因子為3 個評價員嗅聞到的最大稀釋倍數。1.3.3.3 OAV的計算

對FD因子較大的香氣活性化合物定量分析，并計算其OAV。

定量分析：標準溶液配制：用無水乙醇將各標準品配制成單標，然后依次配制成5 個不同質量濃度的混標；標準曲線繪制：取上述配制的5 個不同質量濃度的混標，加入相同質量濃度的內標，分別按照SAFE方法進行萃取，最后定容至2.0 mL。以待定量化合物與對應內標化合物質量濃度之比為橫坐標，以待定量化合物與內標化合物峰面積之比為縱坐標，建立標準曲線，計算樣品中香味活性成分含量。OAV按式（2）計算：

式中：Ci為化合物含量/（μg/kg）；OTi為該化合物在水中的閾值/（μg/kg）。

1.4 數據處理

采用Excel 2010軟件計算7 種重要香氣化合物含量，以 ±s表示。

2 結果與分析

2.1 酒花浸膏揮發性成分分析

表 1 酒花浸膏中揮發性成分GC-MS分析結果Table 1 Volatile compounds in hops extracts as analyzed by GC-MS

續表1

續表1

由表1可知，通過NIST譜庫檢索、保留指數對比及標準品比較共同鑒定出111 種揮發性物質，其中酯類化合物50 種，萜烯類化合物14 種，酸類11 種，酮類11 種，醇類10 種，酚類1 種，吡嗪、吡咯等雜環類化合物5 種，其他類9 種。

由表1可知，SPME法鑒定出酒花浸膏的揮發性化合物70 種：酯類37 種，醇類4 種，酮類7種，酸類5 種，萜烯類13 種，酚類1 種，雜環類3 種。SAFE法鑒定酒花浸膏的揮發性化合物86 種：酯類41 種，醇類9 種，酮類8 種，酸類9 種，萜烯類7 種，雜環類3 種，其他類化合物9 種。SPME法萃取較多易揮發的小分子物質，SAFE萃取出更多如硬脂酸乙酯、亞麻酸乙酯等鏈長較SPME揮發程度低的物質。這是因為SAFE是在高真空、較低溫度條件下提取揮發性成分的方法，利用溶劑在低溫和高真空條件下迅速汽化，輔助目標香氣物質蒸發，除去難揮發物質，使萃取物表現出樣品原有的自然香味，但操作過程中容易損失易揮發類物質[20]。而SPME是萃取頭的選擇性吸附，更易萃取出易揮發的物質，對高沸點長鏈化合物的萃取效果則較差[21]。可見，2 種萃取方式結合能鑒定出酒花浸膏中更多的揮發性成分。

對不同色譜柱的對比分析可知，在GC-MS雙柱定性共鑒定出的111 種化合物中，HP-5MS、TG-WAX分別鑒定出90 種和73 種揮發性化合物，共同鑒定出的化合物有52 種。除酯類和醇類外，經HP-5MS弱極性柱分離鑒定出的酮、酸、萜烯、雜環類和其他類化合物種類數量明顯多于TG-WAX極性柱。可見，2 種色譜柱分離鑒定的化合物種類有明顯差異，同時采用2 種不同類型的色譜柱（強極性和弱極性）對酒花浸膏進行雙柱定性，避免僅一類色譜柱的分離局限性，使揮發性物質的鑒定更加準確和全面[22]。

酒花浸膏中揮發性成分中有42 種化合物在酒花的相關研究中被報道過[12,14-18,23-36]，其余69 種未見報道。酯類物質最多，其次是萜烯類物質。在王露等[13]研究中，萜烯類、酯類也是酒花的主要揮發性成分，這與本研究結果一致。酯類化合物中大多數是低級脂肪酸與脂肪醇生成的具有果香味的酯，如庚酸乙酯、辛酸乙酯等；還有少量芳香族醇的酯類、不飽和烴類羧酸酯、內酯。質量分數較高的有4,4-二甲基-2-丁烯-4-內酯（4.92%～11.13%）、異戊酸乙酯（5.39%～8.35%）、甲基琥珀酸二乙酯（1.45%～5.18%）、(E)-4-癸烯酸乙酯（1.22%～9.77%）、癸酸乙酯（0.57%～5.05%）。甲基琥珀酸乙酯、戊二酸二乙酯、(E)-4-癸烯酸乙酯等化合物是萜烯類氧化物，可能來源于酒花中萜烯化合物的氧化反應。同時，另一些乙酯類化合物，如十一酸乙酯、DL-蘋果酸二乙酯、亞麻酸乙酯等，可能是在加工過程中因與浸提溶劑（乙醇）發生反應而產生。萜烯類化合物是廣泛存在于自然界的一種次生代謝產物，可呈現令人愉快的特殊香氣，在植物中，單萜類化合物和倍半萜類化合物是通過1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸途徑產生的[33]。酒花浸膏中的β-石竹烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、芹子烯、α-衣蘭油烯、杜松烯等化合物已在酒花相關文獻中被報道過[22-25]。石竹烯及其氧化物是酒花中的重要物質，本研究檢測到其他酒花相關文獻中未報道過的6 種萜烯類化合物：巴倫西亞橘烯、?-木羅烯、B-瑟林烯、佛術烯、去氫白菖烯、A-二去氫菖蒲烯。這些物質可能來源于酒花中萜烯類化合物的重排[24]。

酒花浸膏中檢測到的酮類物質中2-十一酮、2-十三酮、丙酮、4-甲基-2-戊酮、2-十二酮5 種化合物已有相關文獻報道。其次，還檢測到酒花中目前未見報道的6 種酮類：2-戊酮、3,3,6-三甲基-4,5-庚二烯-2-酮、3-羥基-3-甲基-2-丁酮、5,5-二甲基-二氫-呋喃-2-酮、環十二酮、3-甲氧基-5-甲基-2-環戊烯-1-酮。酸類物質中，酒花浸膏檢測到目前未報道過的異丁酸、3,3-二甲基丙烯酸和2-羥基異丁酸3 種物質。還檢測到4 種含氮類雜環化合物和1 種物質吡咯物質，分別為2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、4,5-二甲基噻唑、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯。吡嗪、吡咯等雜環化合物是植物體內重要的化學成分，如植物綠色素分子中都含有雜環化合物[37]。

2.2 關鍵性風味成分的確定

表 2 酒花浸膏風味化合物分析結果Table 2 AEDA results of hops extracts

由表2可知，采用SAFE提取酒花浸膏所鑒定出的化合物更多，且對SAFE法萃取得到的濃縮液進行3n等比例稀釋更加簡便、精確。因此，本研究用SAFE法萃取酒花浸膏得到的濃縮液進行GC-O/AEDA嗅聞分析，再對GC-O嗅聞出的對香氣貢獻較大物質進行定量并計算其OAV，結果如表2、3所示。

表 3 重要風味化合物定量分析結果Table 3 Quantitative analysis of important flavor compounds in hops extracts

GC-O共檢測到27 種香氣活性成分：酯類18 種，酸類3 種，酮類2 種，醇類1 種，萜烯類1 種，未知化合物2 種。根據嗅聞結果，酒花浸膏的香氣成分主要為果香、花香、酒香、藥草香、辛辣味、酸味，其次還有芳香、甜味、鳶尾香、皂香等較弱香氣。劉霞[42]、全巧玲等[43]將酒花主要香氣描述為花香、水果香、松脂香、辛辣、苦味。酒花浸膏主要香氣特征與其相似，但由于浸膏是經過酒花提取物，香氣存在差異。在浸膏提取過程中所含與苦味、松脂味相關的化合物含量減少或其成分被破壞，所以在酒花浸膏中沒有檢測到呈苦味、松脂香的化合物。

酒花浸膏的香氣活性成分中以酯類物質含量最多，為酒花浸膏貢獻果香和花香，還有酒香、草香、甜味等。異丁酸乙酯、異己酸乙酯等呈果香，癸酸乙酯、異戊酸乙酯等呈酒香，辛酸乙酯、丙二酸二乙酯呈花香和芳香，苯乙酸乙酯呈蜂蜜甜味，DL-蘋果酸二乙酯、十四酸乙酯等除果香外，還貢獻藥草香和溫和的皂香，壬酸乙酯呈堅果味。這些酯類物質中FD因子較大的香氣成分有異丁酸乙酯（FD=243，果香）、異己酸乙酯（FD=243，果香）、辛酸乙酯（FD=243，果香、花香）、癸酸乙酯（FD=243，果香、發酵酒香）、丁二酸二乙酯（FD=81，令人愉悅的香氣）、苯乙酸乙酯（FD=81，蜂蜜甜）6 種化合物，且大多為乙酯類，這類物質使得酒花浸膏的果香、花香、酒香更加醇厚飽滿。酸類化合物主要在酒花浸膏中貢獻辛辣味和酸味，2-甲基丁酸（FD=729）在高濃度時呈辛辣、刺鼻味，稀釋過后有令人愉快的果味，對酒花浸膏香氣貢獻較大；4-甲基戊酸呈酸臭、刺鼻味，辛酸呈微弱的果味與輕微的酸味，僅能在原樣中聞到。酮類、萜烯類、醇類對酒花浸膏香氣貢獻作用較小。酮類化合物中2-十三酮呈堅果香和藥草香，2-十一酮呈蕓香。李祖光等[44]研究表明2-十三酮、2-十一酮也是紫藤花中重要的香氣物質。萜烯類和醇類僅嗅聞到呈綠茶味、怪味的氧化石竹烯和芳香味的苯甲醇，這可能由于這些化合物閾值較高，在酒花浸膏中的含量低于閾值。

閾值評估和AEDA方法是識別食物中香味活性化合物的廣泛應用技術[45]，本研究計算OAV以進一步補充和支持這些香味活性化合物對酒花浸膏整體香氣的貢獻。通過對FD不小于81的各香氣活性成分進行定量并計算其OAV，可知，含量由高到低依次為異丁酸乙酯（566.13 mg/kg，OAV=566 000）、丁二酸二乙酯（517.46 mg/kg，OAV＜1）、2-甲基丁酸（176.330 mg/kg，OAV=2 939）、異己酸乙酯（123.07 mg/kg，OAV=41 023）、辛酸乙酯（110.610 mg/kg，OAV=22 122）、苯乙酸乙酯（42.73 mg/kg，OAV=65）、癸酸乙酯（35.55 mg/kg，OAV=4 444），這7 種化合物中丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯由于閾值較大，OAV值較低，其他5 種化合物OAV都大于1 000。綜上，篩選出酒花浸膏中的關鍵性香氣成分為異丁酸乙酯、2-甲基丁酸、異己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯這5 種物質。

3 結 論

采用SPME和SAFE兩種前處理方法，結合GC-MS對酒花浸膏的揮發性成分進行分析，定性出111 種揮發性物質，首次報道69 種。經GC-O/AEDA對酒花浸膏中的香味活性成分分析，共檢測到包括酯類、酸類、酮類、醇類、萜烯類的27 種香氣物質，FD因子不小于81的香氣活性物質有7 種，對其進行定量并計算OAV，異丁酸乙酯含量最高。結合FD因子和OAV分析，最終確認酒花浸膏的關鍵香氣成分為異丁酸乙酯、2-甲基丁酸、異己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯這5 種化合物。