鹽藻固體培養基分離純化方法的建立

王新磊，李炳乾，張云澤，鄭秀潔，艾日肯江·庫爾班江，辛乃宏

(1.新疆湖鹽工程技術研究中心，新疆精河 833300；2.中鹽工程技術研究院有限公司，天津 300450)

鹽藻是鹽生杜氏藻的簡稱，是一種真核藻類，可在飽和氯化鈉的極端高鹽環境下(NaCl濃度高于30%) 生長[1]，在一定條件下，鹽藻體內β-胡蘿卜素[2～3]可高達8%～10%(干重)[4]，并富含30%左右甘油和30%～40%蛋白質以及脂肪酸、葉綠素和四烯油等，β-胡蘿卜素營養價值極高，國內外已廣泛用于醫藥、食品中[5-7]。鹽藻體內營養物質的積累不僅與培養條件有關，而且與鹽藻的品系也有很大的關系。鹽藻在養殖一段時間后容易老化也容易感染其他生物，因此，需要定期進行鹽藻的分離純化才能滿足生產上的需要。目前，鹽藻的分離純化主要采用稀釋分離法、微細管分離法[8-11]。稀釋分離法操作比較簡單，但工作量大，成功率低。微細管分離法雖然成功率高，但因鹽藻有鞭毛一直處于游動狀態，需要相對專業的人員操作才能完成。文章發明了一種采用固體培養基純化分離鹽藻的方法，在實際生產應用中獲得了比較好的效果。

1 材料與方法

1.1 鹽藻來源

待分離的鹽藻采自新疆精河縣精河鹽化有限責任公司鹽田儲鹵池。

1.2 鹽藻密度

以血細胞技術板在顯微鏡下計數。

1.3 鹽藻培養

篩選的鹽藻在采用Modified Johnsons Medium (J/l)[12]培養基，用1 000 mL三角瓶置于光照培養箱中培養。

1.4 試驗方法：

將一定量的瓊脂(REGULAR AGAROSE G-10)放入不同鹽度的鹽藻培養基中，經過高溫滅菌后冷卻至50 ℃～70 ℃，置于恒溫水浴鍋中保持一定溫度，然后加入一定量的待分離鹽藻藻液，混勻。無菌條件下將含有鹽藻藻液的瓊脂倒入已滅菌過的培養皿中，冷卻后用封口膜密封。倒置于光照培養箱內培養。鹽藻由單個細胞生長成細胞團后，用鑷子或接種環挑取鏡檢，選擇純種的鹽藻培養。

實驗分別從接種溫度、瓊脂濃度、培養基鹽度、接種鹽藻密度四個方面著手研究(表1)。

表1 試驗項目及條件數據的選擇Tab.1 Selection of test items and conditional data

2 結果與分析

2.1 接種溫度的選擇

鹽藻的溫度耐受范圍比較廣，最適生長溫度在25 ℃～32 ℃。試驗對接種溫度的選擇主要是考慮到瓊脂的凝固與溫度有關。試驗選用了35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃這四個溫度進行接種培養，接種后觀察鹽藻的情況(圖1)。

從圖1可見，鹽藻接種培養溫度在40 ℃以下時，細胞密度快速增長；接種培養溫度在45 ℃時，鹽藻密度變化不大，鹽藻活力降低；鹽藻接種培養溫度在50 ℃時，鹽藻細胞先停止運動后逐漸破裂死亡。因此，在選擇接種溫度時應控制在45 ℃以下。

圖1 鹽藻在不同接種培養溫度下的生長情況Fig.1 Growth of dunaliella salina under different inoculation and culture temperatures

2.2 瓊脂濃度的選擇

瓊脂濃度與溫度具有一定的對用關系，在一定的溫度下，瓊脂濃度越大，越容易凝固；在一定的瓊脂濃度下，溫度越低，越容易凝固。試驗根據鹽藻的接種溫度試驗選擇了35 ℃、40 ℃和45 ℃三個溫度用于確定對應的瓊脂的凝固濃度(表2)。

表2 不同濃度的瓊脂在不同溫度下的狀態Tab.2 The state of agars with different concentrations at different temperatures

從表2可見在35 ℃時，試驗用瓊脂濃度均有不同程度的凝固；40 ℃時瓊脂濃度從1.0%開始出現凝固現象；45 ℃時瓊脂濃度從1.2%開始出現凝固現象。

從上面兩組試驗的結果可以分析得出，適合用于鹽藻接種的溫度為40 ℃～45 ℃,瓊脂濃度為0.6%～1.0%。

2.3 培養基鹽度的選擇

鹽藻可在2%～39%鹽度的鹽水中存活，富集β-胡蘿卜素時鹽度應在15%以上。單個鹽藻細胞在培養基內生長20 d～30 d才能形成容易觀察的細胞團，該試驗的目的是為了找到既能保持鹽藻生長的鹽度環境，又不形成結晶的鹽度。試驗選取了五個培養基的鹽度進行試驗，分別是4%、6%、8%、10%和12%，結果見表3。

表3 不同培養基鹽度在30 ℃條件下培養30 d的情況Tab.3 The condition of 30 days in cubation at 30 ℃ with different medium salinity

從表3可見，培養基在30 ℃培養30 d的情況下，鹽度大于10%時，培養基表面形成鹽結晶，鹽度低于8%時不容易形成結晶。

2.4 接種鹽藻密度的選擇

根據密度計算及實際操作經驗，選取了1×102個/L，1×103個/L，1×104個/L和1×105個/L四個梯度進行接種培養試驗，結果見表4。

從表4可見，接種密度在1×102個/L時，固體培養基內生長的細胞團較少；接種密度在1×105個/L時，細胞團密度大，相互之間有所接觸，挑選單個細胞團的難度非常大。

表4接種不同密度的鹽藻的培養效果
Tab.4 Culture effect of salina inoculated with different densities

因此，鹽藻在培養基內接種的密度不能過低，過低時可供篩選的細胞團數量少，容易失去目標細胞；密度濃度過高，細胞團密度大，容易造成相鄰的細胞團之間接觸，失去了篩選的意義，因此，建議的接種密度在1×103個/L～1×104個/L為佳。

2.5 新方法培養試驗

新方法培養鹽藻的試驗是根據上面試驗中得到的接種溫度、瓊脂濃度、培養基鹽度、接種鹽藻密度的結果或分析，對其選取端值進行具體試驗，驗證試驗效果(見表5)。

表5接種不同密度的鹽藻的培養效果
Tab.5 Experiments on new method of solid culture medium for cultivating dunaliella salina

從表5可見，在所選取的各條件下培養鹽藻，鹽藻細胞均能形成細胞團(細節見圖2、圖3)。接種密度為1×104個/L時的細胞團密度明顯高于接種密度為1×103個/L所形成的細胞團。

3 討論

3.1 目前常用的微藻分離方法在鹽藻分離純化應用中的情況

目前，常用的微藻分離方法有稀釋分離法、微吸管分離法、傳統固體培養基分離法，下面將分別討論其在鹽藻方面的應用情況。

稀釋分離法，即用滅菌后的培養液把待分離的藻液不斷梯度稀釋，稀釋到每一滴液體中只有一個微藻細胞為止。直接將稀釋后的藻液吸取一滴接入預先準備好的裝有無菌的培養液中進行培養，培養一段時間后鏡檢，若為單種則分離純化成功，若非單種則需要繼續純化直到分離出藻液為單種為止[8～9]。該方法操作簡單，但目的性較差，不一定能分離到所需的單種，需要進行大量重復操作培養，目標成功率極低。

微吸管分離法是將玻璃滴管在酒精噴燈上加熱(或玻璃毛細管在酒精燈上加熱)，用鑷子拉成的極細的微管。在顯微鏡下把目標微藻吸入微吸管，然后接入到預先準備好的裝有無菌的培養液中進行培養[9]。微吸管分離法是獲得單細胞藻類最常用并且是成功率最高的方法，也是當前鹽藻分離純化中最常用的方法。但微吸管法對試驗儀器和操作人員的要求比較高，且鹽藻細胞有鞭毛可以游動，增加了操作的難度。

傳統固體培養基分離法是在微藻培養基中加入1%～2%的瓊脂進行高壓蒸汽滅菌，滅菌后待培養液倒入無菌培養皿中制成固體培養基備用，然后將微藻以劃線、噴霧和涂布的方法接種到培養基表面。該方法是目前淡水藻、海洋微藻和細菌篩選最常用的方法。但該方法不適合鹽藻的篩選，主要是因為鹽藻培養液鹽度高，三種方法均是將鹽藻細胞置于瓊脂培養基表層，這會導致鹽藻在生長為細胞團前有鹽析出甚至干掉而導致失敗。

3.2 固體培養基新方法在鹽藻分離純化應用中的優勢

固體培養基新方法是在傳統固體培養基方法的基礎上針對鹽藻設計的一種分離純化方法，目前經過試驗驗證其效果非常好。 固體培養基新方法是讓鹽藻在瓊脂內部生長，既可以把鹽藻固定又不影響鹽藻生長繁殖，非常容易形成單細胞群落，該方法不僅可用于鹽藻的分離純化，還可用于其他微藻的分離純化使用。

該方法可使單個的鹽藻細胞在瓊脂內的立體空間中固定，在鹽藻細胞尚未分裂繁殖時加以處理或者引導(物理或化學刺激)，可以使細胞發生定向性變異，然后根據變異的特征從細胞團中選取誘變成功的鹽藻細胞，進而挑選培養。

微藻藻種保存時需要根據其繁殖生長情況定期進行更換培養基，硅藻通常在15 d左右更換一次培養基，綠藻通常在25 d左右更換一次培養基，鹽藻根據培養條件通常在40 d～50 d更換一次培養基。該方法培養微藻因接種密度低，瓊脂保水效果好，即可以延長保種時間并且每次接種都能對微藻進行純化。因此，該方法用于微藻藻種的保存,效果非常好。

4 結論

固體培養基分離純化鹽藻的新方法中，建議接種溫度為40 ℃～45 ℃；瓊脂濃度為0.6%～1.0%；培養基鹽度為6～8%；接種鹽藻細胞濃度為1×103個/L～1×104個/L。該方法操作簡單，不需要專業人員操作即可完成，可復制性強，分離純化效果非常好，特別適合類似于鹽藻等可游動的微藻進行分離純化。