標本離體固定時間對熒光原位雜交技術檢測乳腺浸潤性導管癌HER2基因的影響▲

詹曉芬 王少洪 況麗平 邱曉陽 李 帆

(廣東省汕頭市中心醫院病理科，汕頭市 515031，電子郵箱：2565458852@qq.com)

乳腺癌是嚴重危害我國女性健康的惡性腫瘤，每年新增病例約21萬，死亡率近10/10萬[1]。《乳腺癌HER2檢測指南(2014版)》中明確指出，所有乳腺原發性浸潤癌必須檢測人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)[2]。規范化的標本離體固定時間是確保乳腺浸潤性導管癌HER2基因檢測結果的關鍵，但在實際臨床診療工作中并沒有得到真正的重視。目前國內僅有少許文獻報告了標本離體不同固定時間檢測對細胞形態[3]、胃癌HER2檢測結果的影響[4]，尚未見關于不同標本離體固定時間對乳腺浸潤性導管癌HER2基因擴增效果影響的報道。本研究通過收集不同的離體時間段內固定的乳腺浸潤性導管癌標本，采用熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技術檢測HER2基因的表達情況，并分析不同離體時間乳腺浸潤性導管癌標本間HER2基因表達和擴增情況的差異，為優化乳腺浸潤性導管癌HER2基因檢測流程中規范標本離體固定時間提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HER2探針(生產批號：2016002、2016012、2017010、2018003)由北京金菩嘉醫療科技有限公司生產，其是含有HER2基因/第17號染色體著絲粒(CEP17)的雙色探針。10%中性緩沖福爾馬林固定液(生產批號：16021603、16091905、17062201、18011705)由廣州維格斯生物科技有限公司生產。Tissue-Tek?VIPTM電腦全封閉脫水機、Tissue-Tek? Y0213990044全自動染色封片機均購自日本櫻花公司；Leica RM2135石蠟切片機由德國徠卡公司生產；Olympus BX51熒光顯微鏡由日本奧林巴斯株式會社生產；S500-24熒光原位雜交儀由美國ThermoBrite公司生產。

1.2 標本來源及分組 選擇2016年5月至2018年6月間在我院就診的、未接受過任何治療的原發性乳腺浸潤性導管癌患者116例，乳腺癌的診斷依據參考乳腺腫瘤最新分類標準[5]。常規石蠟切片、伊紅-蘇木精染色流程參照文獻[6]進行。將每例患者送檢的同一病變部位組織呈書頁狀切開成5份，根據標本的不同離體時間，將標本分別編入A、B、C、D、E組，各組標本離體時間分別為5 min、30 min、60 min、90 min、120 min。

1.3 方法

1.3.1 FISH法檢測乳腺浸潤性導管癌組織HER2基因：針對各組對應的標本離體固定時間，采用10.0%中性緩沖福爾馬林固定液將各組標本固定24 h后制作常規組織切片。按文獻[7-9]進行FISH檢測。為保證實驗的可信度，實驗過程設置了陰、陽性對照。

1.3.2 HER2基因檢測結果的判定標準[2]：(1)HER2/CEP17比值>2.0時，或HER2與/CEP17比值<2.0，但平均HER2拷貝數/細胞≥6.0均判為HER2陽性；(2)HER2/CEP17比值<2.0且平均HER2拷貝數/細胞<4.0時為HER2陰性。

1.3.3 觀察指標：(1)熒光顯微鏡下不同離體固定時間乳腺浸潤性導管癌組織的形態學表現。(2)不同離體固定時間乳腺浸潤性導管癌組織HER2基因陽性檢出情況。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組標本熒光鏡檢結果 熒光顯微鏡下，A、B、C組的細胞輪廓完整、背景干凈、探針定位精準，橘紅/綠色熒光信號呈成簇狀(見圖1A～圖1C)。D、E組的細胞輪廓逐漸模糊，可見細胞碎片、核溶解甚至細胞融合，熒光信號不規則甚至消失，橘紅/綠色熒光信號強度及數量較A、B、C組減弱、減少(見圖1D、圖1E)。

圖1 各組標本HER2基因熒光鏡檢結果(FISH法，×1000)

注：細胞核為深藍色熒光信號，CEP17探針為綠色熒光信號，HER2探針為橘紅色熒光信號。A～E分別是A～E組乳腺浸潤性導管癌組織熒光鏡檢圖像。

2.2 各組標本HER2基因陽性檢出情況 A～E組標本中HER2基因的陽性檢出率分別為28.5%(33/116)、28.5%(33/116)、26.7%(31/116)、15.5%(18/116)、8.6%(10/116)。各組HER2基因的陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=22.33，P<0.001)；進一步分析結果顯示，A、B、C組HER2基因陽性檢出率均高于D、E組(均P<0.05)。

3 討 論

HER2是一種原癌基因，與乳腺癌的發生、發展、臨床治療與疾病預后密切相關[10-11]。在組織標本的制備過程中，規范的標本離體固定時間是保證乳腺浸潤性導管癌HER2基因檢測結果準確性的基礎，因此，探討不同離體固定時間對FISH法檢測HER2基因的影響具有重要意義。

本研究中，A、B、C組熒光顯微鏡檢的細胞輪廓完整性、背景干凈度明顯優于D、E組，且橘紅/綠色熒光信號強度及數量呈逐漸下降或者減弱的趨勢；而在對不同離體固定時間標本HER2基因陽性檢出率的分析中，我們發現各組乳腺浸潤性導管癌組織的HER2基因陽性檢出率具有差異，且A、B、C組HER2基因陽性檢出率均高于D、E組(均P<0.05)，而A、B、C組間陽性檢出率比較無差異(P>0.05)，提示采用FISH法檢測乳腺浸潤性導管癌HER2基因時，標本離體固定時間在5～60 min內的檢測結果相對真實、穩定，而標本離體固定時間超過60 min則可能引起偏差。我們認為出現這一現象的原因可能是隨著標本離體固定時間的延長，未及時固定的組織可發生自溶及腐爛，細胞內各種成分發生變性、碎裂，部分DNA結構開始出現破壞、消失，出現細胞碎片、融合、非特異著色、熒光探針強度數量及定位異相等現象。

本研究結果顯示，A～C組乳腺浸潤性導管癌組織HER2基因陽性檢出率為26.7%～28.5%，與相關研究[12-14]結果相似。盡管A～C組HER2基因陽性檢出率差異無統計學意義，但C組比A、B組均少了2例陽性病例，這可能是因為隨著標本離體時間的增長，DNA結構破壞的現象越來越明顯，從而導致HER2基因陰性的檢測結果。因此，我們認為在采用FISH法檢測乳腺浸潤性導管癌HER2基因時，標本離體固定時間以30 min內為佳，最長不應超過60 min。

綜上所述，標本離體固定時間可影響FISH法檢測乳腺浸潤性導管癌HER2基因的結果，標本離體固定時間以30 min內為佳，最長不應超過60 min。本研究存在一定局限性，如研究時限短、樣本量偏小等，下一步我們將加大樣本量和延長研究時限來驗證其結論。