骨質(zhì)增生丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

蒲志強(qiáng)，陳 華，金偉華，于波濤，宋宗輝

（中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，四川 成都 610083）

骨質(zhì)增生丸為我院非標(biāo)準(zhǔn)制劑，由于原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、不可控，且僅有骨碎補(bǔ)和熟地黃的薄層色譜（TLC）鑒別方法，因此需要提高制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。骨質(zhì)增生丸由雞血藤、熟地黃、骨碎補(bǔ)、狗脊、獨(dú)活等11味中藥組方，為臨床使用多年的經(jīng)驗(yàn)方，有滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋壯骨、驅(qū)風(fēng)散邪、助陽化濕、活血化瘀功效，多用于頸椎病、肥大性腰椎炎、退行性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、慢性腰腿病等的治療。本研究中對(duì)方中骨碎補(bǔ)、鹿銜草、熟地黃等成分進(jìn)行定性鑒別，對(duì)柚皮苷進(jìn)行含量測(cè)定[1]。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AL204型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；硅膠G板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；硅膠H板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥

柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110722-200610，純度＞98%），鹿銜草對(duì)照藥材（批號(hào)為121211-201202），熟地黃對(duì)照藥材（批號(hào)為121196-201105），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；骨質(zhì)增生丸（批號(hào)分別為 141101，141102，141103，規(guī)格為每袋6 g）及陰性樣品均由醫(yī)院制劑中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 骨碎補(bǔ)[2]

取樣品10 g，研細(xì)，加甲醇50 mL，超聲（功率240 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取柚皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。另取缺骨碎補(bǔ)的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸-水（1∶12∶2.5 ∶3，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1 A。

2.1.2 鹿銜草[3]

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜圖

取樣品10 g，研細(xì)，加乙醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取鹿銜草對(duì)照藥材1 g，加乙醇20 mL，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。另取缺鹿銜草的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以環(huán)己烷 -甲酸乙酯 -甲酸（5∶4∶1，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1 B。

2.1.3 熟地黃[4]

取樣品 10 g，研細(xì)，加水 50 mL，超聲處理 30 min，濾過，濾液置分液漏斗中，加乙酸乙酯25 mL，振搖提取，分取乙酸乙酯層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取熟地黃對(duì)照藥材1 g，置錐形瓶中，加水30 mL，煎煮1 h，濾過，即得對(duì)照藥材溶液。另取缺熟地黃的陰性樣品10 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼試液，顯色至斑點(diǎn)清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1 C。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[5-7]

色譜柱：YMC-TriartC18柱（250mm ×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（19 ∶81，V／V）；流速：1mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含30 μg的對(duì)照品溶液。取樣品適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取不含骨碎補(bǔ)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖2。結(jié)果理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖2。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品各適量，加50%甲醇制成每 1 mL 中含柚皮苷 2.9，5.8，11.6，23.2，46.4，92.8 μg的系列對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以柚皮苷質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝12.643 X-2.804，r＝0.999 9(n ＝6)。結(jié)果表明，柚皮苷質(zhì)量濃度在 2.9 ～92.8 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定 6次，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.37%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液(批號(hào)為141101)適量，分別于室溫下放置 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為2.16%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品(批號(hào)為141101)適量，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果柚皮苷平均含量為0.779mg／g，RSD 為 2.16%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的柚皮苷對(duì)照品溶液，同法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果批號(hào)為141101，141102，141103的3批樣品中柚皮苷的含量分別為 0.736，0.751，0.771mg／g。

3 討論

骨質(zhì)增生可發(fā)生于全身各部位，臨床表現(xiàn)也錯(cuò)綜復(fù)雜[8]。骨質(zhì)增生屬于無菌性炎癥，治療時(shí)應(yīng)控制骨質(zhì)增生引起的局部組織充血、水腫、炎癥等一系列癥狀和體征。該組方從補(bǔ)腎健骨、扶正祛邪、活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)的角度配伍，方中熟地黃滋陰益腎、養(yǎng)肝補(bǔ)脾，雞血藤補(bǔ)血活血、舒筋活絡(luò)，獨(dú)活祛風(fēng)除濕、驅(qū)散風(fēng)邪，生麥芽、生谷芽益脾補(bǔ)腎，諸藥協(xié)同發(fā)揮療效，制備為骨質(zhì)增生丸，更能滿足廣大骨質(zhì)增生患者的用藥需求。

骨碎補(bǔ)TLC顯色后，薄層板需放置足夠時(shí)間，熒光才夠清晰，同時(shí)展開劑應(yīng)選擇環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸-水（1∶12∶2.5∶3，V／V／V／V）的上層溶液[9]。藥典中骨碎補(bǔ)和鹿銜草的薄層鑒別展開劑均使用了甲苯，但甲苯為易制毒化學(xué)品，屬于管制品，所以該兩味藥材的鑒別中用環(huán)己烷替代了甲苯。

柚皮苷檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，以甲醇為溶劑，稱取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，使用紫外可見分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描[10]，結(jié)果柚皮苷在283 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，通過系統(tǒng)適用性試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果分離度良好，樣品中柚皮苷與對(duì)照品保留時(shí)間一致，陰性無干擾。

處方中熟地黃為生地黃的炮制加工品，具有清熱生津、涼血止血作用，《中國(guó)藥典》建立了其活性成分梓醇、毛蕊花糖苷的含量測(cè)定方法，試驗(yàn)時(shí)由于缺少對(duì)照品，故未將其作為含量測(cè)定指標(biāo)。肉蓯蓉含有松果菊苷、毛蕊花糖苷等指標(biāo)成分。狗脊中含有原兒茶酸，但《中國(guó)藥典》中其藥材的含量限度比較低。獨(dú)活含有蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯，《中國(guó)藥典》也建立了相應(yīng)含量測(cè)定方法。《中國(guó)藥典》中鹿銜草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下建立了水晶蘭苷的含量測(cè)定方法。《中國(guó)藥典》中骨碎補(bǔ)以柚皮苷為含量測(cè)定指標(biāo)，本品按干燥品計(jì)算，含柚皮苷應(yīng)不得少于0.50%。經(jīng)過篩選，本研究中采用柚皮苷為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。進(jìn)一步研究時(shí)可以考慮增加毛蕊花糖苷、蛇床子素、水晶蘭苷等指標(biāo)成分的含量測(cè)定[11]。

綜上所述，本研究中所建立的標(biāo)準(zhǔn)操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于骨質(zhì)增生丸的質(zhì)量控制。參考文獻(xiàn)：

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