利用分叉微通道提高夾切進樣微流控芯片電泳可靠性的探索

魏 軒，王 琰，王兆彥，蒲巧生*

(1.蘭州大學 化學化工學院，甘肅 蘭州 730000；2.通化師范學院，吉林 通化 134002；3.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000)

微流控芯片電泳分析速度快、試劑和樣品消耗量少，在基因分析[1-4]、藥物分析[5-6]、食品安全[7]和醫療診斷[8-9]等領域具有廣闊的應用前景。夾切進樣是微流控芯片電泳常用的進樣方式之一，該方式利用電場控制進樣區帶的大小，使用方便[10]。但在微流控芯片電泳的實際操作中，該方式仍存在一些需要解決的問題。首先，進樣所需時間比較長。在夾切進樣過程中，樣品池中的待測物質是在電場驅動下遷移到十字或雙T結構處，然后進入分離通道完成分離。由于各待測物質電遷移速率的差異[11-13]，為保證分析結果的可靠性，進樣時間取決于有效電遷移速度最慢的成分[14-16]，耗時很長(與分離所需時間相比)。其次，在多次進樣-分離循環中，樣品可能被運行緩沖液稀釋，導致進樣區帶中分析物濃度低于樣品中的實際濃度，且重現性變差。再次，隨著進樣次數的增加，樣品廢液池的溶液逐漸增多，引起分離通道中的壓力流動，造成峰形拖尾和重現性變差[17]。最后，進樣階段施加在分離通道上的電壓會將前一次分離的樣品推回檢測位點，造成基線的抬升或漂移。Revermann等[18]通過綜述總結了解決這些問題的方法。如Thomas等[10]提出了一種多次夾切進樣的方法，但該進樣方式需要6根電極，增大了系統的復雜程度；Lin等設計了帶有廢液移除功能的流通式芯片，重復進樣3 h以上仍能保持很好的重復性[19]，但該方法需額外的注射泵，且樣品和試劑消耗量較大；Karlinsey等通過在PDMS-glass芯片上整合隔膜泵壓力注射來消除樣品的進樣歧視[20]，但這種芯片制作過程比較復雜；Luo等在雙十字芯片上通過排空樣品廢液槽產生的液體靜壓力來實現樣品的進樣，其中一個十字用來形成樣品塞，另一個十字用來對樣品塞進行調控，該雙十字芯片能夠重復進樣33次[21]。最近，Majarikar等利用帶有旁路結構的微流控芯片來自動補償微流控芯片電泳中壓力差引起的流動，但該方法不適合離子強度較大的緩沖體系[22]。

本研究在進樣和分離微通道中引入分叉結構，增加額外的樣品廢液池和緩沖廢液池，利用液面差實現進樣微通道入口端和分離通道出口端溶液的連續更新，在不引入其它設備，也不會顯著加大芯片制作難度的前提下，有效解決了上述問題，顯著提高了微流控芯片電泳的重復性，且有一定程度的樣品預分離能力。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

研究所用四路程控高壓電源和激光誘導熒光檢測器均由本課題組設計制作。其中高壓電源由4個高壓模塊(DW-P303-1AC，東文高壓電源(天津)股份有限公司)、繼電器和控制電路構成，輸出電壓0～3 000 V可調。激光誘導熒光(LIF)檢測器由MBL-Ⅲ-473二極管泵浦全固態藍色激光器(長春新產業光電技術有限公司)、顯微鏡物鏡(40×，重慶麥克光電儀器有限公司)、DM 505二向色鏡和BP 520長通濾波器(沈陽匯博光學技術有限公司)組成。檢測器采用共聚焦光路，激光照射到二向色鏡上(45°放置)，經二向色鏡反射到物鏡，聚焦至微流控芯片檢測點，激發的熒光被同一物鏡收集，經二向色鏡、長通濾波器聚焦到CR105-01光電倍增管(北京濱松光子技術股份有限公司)前的針孔上。產生的光電流經放大濾波后由USB-6008多功能采集卡采集，高壓電源和LIF檢測器均通過USB6008控制，用Labview編寫的程序實現高壓輸出控制和電泳譜圖的顯示、存儲、譜圖積分等功能。

草甘膦(GLYP)、草銨膦(GLUF)和氨甲基膦酸(AMPA)購自德國Riedel-de Ha?n公司；異硫氰酸熒光素(FITC)購自Sigma-Aldrich公司；硼砂、羥丙基纖維素(HPC)購自上海Bio Basic公司；西蘭花購于當地市場；其它試劑均為分析純。

1.2 樣品處理與衍生

稱取5 g西蘭花，用榨汁機榨汁，汁液靜置1 min后取其上層清液，用0.45 μm的濾膜過濾，取濾液放入冰箱中保存待用。樣品衍生參照文獻[23]進行，衍生后立即進行微流控芯片電泳分析。

1.3 微流控芯片的制作

研究所用環烯烴共聚物(COC)微流控芯片均采用改進的金屬絲熱壓法制作，詳細制作流程參考文獻[24]，過程簡要描述如下：①首先將COC片裁成6.0 cm×1.5 cm的長方形小片，然后依次用1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl、超純水清洗，于70 ℃烘箱中烘干；②將直徑80 μm的細銅絲按預定的方式固定在載玻片上，把COC片放在銅絲上面，再蓋一片載玻片，用3對長尾票夾對稱夾緊固定，置于140 ℃的烘箱中加熱25 min；③取出自然冷卻使COC片與載玻片分開，將帶有銅絲的COC片放入硝酸溶液中；④待銅絲完全溶解后，水洗，空氣吹干，在COC片的適當位置打孔(直徑3 mm)，用超純水和無水乙醇清洗；⑤將另一片COC片蓋在通道上，并將這兩片COC夾在兩片載玻片中，于122 ℃烘箱中加熱10 min完成兩片COC的封接；⑥在打孔位置粘上儲液池，并用COC的甲苯溶解液密封邊沿，即可得到所需的微流控芯片。

圖1 具有分叉微通道結構的電泳芯片示意圖Fig.1 Schematic diagram of a microchip with branched microchannels

1.4 微流控芯片電泳分離

微流控芯片(圖1)的6個儲液池分別標記為S(樣品池)、SW(樣品廢液池)、SW’(額外的樣品廢液池)、B(緩沖液池)、BW(緩沖廢液池)、BW’(額外的緩沖廢液池)，各液池中所加溶液體積分別為100、100、30、100、100、30 μL。進樣階段中，SW池加400 V電壓，SW’池接地，B池和BW’池分別加140 V和80 V電壓來限制樣品區帶的寬度。分離階段，B池和BW’池的電壓切換為0 V和1 800 V，實現電泳分離。同時，SW池和SW’池的電壓切換為700 V和600 V，防止樣品滲漏進入分離通道。

2 結果與討論

2.1 微流控芯片微通道設計思路

Crabtree等[17]早在2001年就報道了壓差引起的流動對微流控芯片電泳重現性的影響，Revermann等[18]詳細討論了微流控芯片電泳面臨的問題和解決方法。仔細調整各儲液池中的溶液體積、及時更換儲液池中的溶液是提高微流控芯片電泳重現性的重要途徑。由于電泳過程中各儲液的液面會隨時間變化，為保證分析結果的重現性，必須增加溶液更換的頻次，這勢必影響總的分析速度，也增加了微流控芯片電泳的操作難度，不利于其實際應用。夾切進樣是一種理想的微流控芯片電泳進樣方法，但存在進樣時間長的問題。采用該方式連續進樣分析時，進樣階段施加在分離通道出口端的夾切電壓會將前次分離的分析物和樣品基體推回分離通道檢測位點，導致基線異常抬升，影響分析重現性。

為解決這些問題，本研究在進樣通道和分析通道末端引入了分叉結構，增加了額外的樣品廢液池和緩沖廢液池(圖1)。基本思路是SW’和BW’僅加入少量溶液(30 μL)，借助S和SW’、BW和BW’之間的液面差來維持連續流動，4根電極分別加在B、BW’、SW、SW’儲液池中。溶液流向如圖2所示，在進樣階段，由于電場的作用樣品從S與SW’之間的分叉點進入進樣通道流向SW，而S和SW’的液面差阻止了SW’中的溶液回流，分叉點始終為新鮮樣品(未被稀釋也未受電解影響)。同樣，BW的BW’的液面差也阻止了BW’中的溶液進入分離通道，防止多次進樣分離后廢液池中的樣品在進樣時被夾切電壓反推進入分離通道引起基線的異常抬升。分離階段，在電場的作用下樣品區帶從進樣十字進入分離通道向緩沖廢液池遷移，由于BW和BW’的液面差，使得分離過程中的廢液全部流向BW’，保證了分離通道末端始終為新鮮緩沖溶液。S和SW’之間分叉點的顯微熒光照片顯示，在進樣階段樣品可以穩定進入進樣通道，而分離階段樣品不會進入進樣通道(圖3)。需要說明的是，S和SW’之間的流動不會顯著增加樣品的消耗(測量得出的S和SW’之間樣品的流速僅為3.6～5.2 μL/h)。

采用具有分叉結構微通道的芯片進行電泳分離，多次重復進樣未觀察到基線抬升的現象，說明這種芯片通道設計可行。

圖2 進樣(A)和分離(B)階段通道內的溶液流向示意圖Fig.2 Schematic diagram of flow direction during injection(A) and separation(B) phases

2.2 進樣時間與進樣通道長度的影響

以FITC標記的有機磷除草劑及其降解產物為模型，在帶有分叉結構微通道的芯片上，考察了進樣時間對出峰個數的影響(圖4A)。結果顯示，進樣時間為30 s時即可保證3種除草劑出峰，進一步延長進樣時間衍生試劑FITC的峰才會出現，這意味著可通過控制進樣時間來達到簡化譜圖的目的。為了進一步證實利用該方法簡化譜圖的可行性，采用FITC衍生的西蘭花汁液作為樣品，在同樣條件下測試了進樣時間的影響(圖4B)，發現進樣時間為45 s時，樣品中大量的基體物質進入分離通道出峰，譜圖非常復雜，進樣時間為35 s時譜圖相對簡單，進樣時間為30 s則僅有3種有機磷化合物的峰。因此通過選擇合適的運行緩沖介質，盡可能使待測組分在前面出峰，同時控制進樣時間，可以達到簡化譜圖的目的。這樣也避免了大量樣品基體進入分離通道，減小了分離通道污染的可能性。

將LIF檢測位點置于進樣通道時所獲得的譜圖也證實了這一點，對于FITC衍生的3種有機磷混合物，譜圖呈現兩個明顯的平臺，說明進樣通道中發生了分離(迎頭模式)(圖5)。

圖5 進樣通道檢測信號Fig.5 Fluorescent signal detected at the sampling microchannelsample:FITC labeled GLYP,AMPA and GLUF；detected at a point of 0.4 cm from the cross

實驗還考察了進樣通道長度(從分叉點到十字)為0.5、0.8、1.0、1.3、1.5 cm的微流控芯片的分離效果，發現不同長度的微流控芯片均可實現簡化譜圖的目的，使用時可靈活選擇。S池及SW’池至分叉點的距離相等，均為1 cm,受儲液池布局限制，未嘗試其它長度。

圖6 連續進樣分離120次的電泳譜圖Fig.6 Electropherograms of a consecutive injection and separation of organophosphorus herbicides(n=120)analytes are same as those in Fig.4;insert:enlarged electropherograms of 11,51 and 91st injection

2.3 重復性

采用這種具有分叉結構的微流控芯片時，由于電極放置在BW’池，既使長時間運行也不會因電解產物影響分離通道中運行緩沖液組成，這有利于提高電泳分析的穩定性。實驗證實采用該芯片可以至少進行40次連續進樣分析，40次后更換各儲液池中的溶液，即可開始下一輪連續測定。圖6是120次連續分析的譜圖，以氨甲基磷酸的峰高計算得到的相對標準偏差(RSD)為0.56%。在本實驗條件下，每運行40次更換溶液的原因是研究所用微流控芯片的儲液池體積較小(150 μL)，緩沖液池中的電解會改變運行緩沖液的pH值，溶液的揮發也會改變緩沖液濃度，因此采用更大的緩沖液池應該能夠增加穩定連續進樣的次數。

3 結 論

本研究在進樣通道和分離通道末端引入分叉結構，增加額外的樣品廢液池和緩沖廢液池，并在樣品池與額外的樣品廢液池、緩沖廢液池和額外的緩沖廢液池之間維持一定的液面差，保持進樣通道和分離通道末端溶液的持續更新，可有效縮短多次連續進樣分離時的進樣時間，消除基線異常抬升等問題，顯著改善了夾切進樣微流控芯片電泳連續進樣分析的重現性。由于電極置于額外的樣品廢液池，避免了電解對樣品的影響。對于待測物提前出峰的情況，還可以通過控制進樣時間來避免大量的樣品基體成分進入分離通道，減小了分離通道污染的可能性，簡化了譜圖。方法可提高微流控芯片電泳的可靠性，對促進其實際應用有一定的參考意義。