拉曼光譜技術在現場快檢分析領域中的應用

呂前輝，王小華，沈愛國，胡繼明

(生物與醫學分析化學教育部重點實驗室，武漢大學 化學與分子科學學院，湖北 武漢 430072)

隨著社會經濟的蓬勃發展，民眾對生活質量的要求也越來越高，在食品安全、醫藥管理、刑事偵查和環境監測等領域內，亟需快速、方便的現場檢測技術。拉曼光譜技術以其操作簡單、快速、無損、需樣量少、適于含水體系等優勢在上述領域內得到了迅速推廣。由于拉曼散射是基于光與物質作用后產生的對稱分布在瑞利散射光兩側的非彈性光散射效應，其散射光與入射光頻率的位移對應于被散射分子的組成和結構，故可對被散射分子的組成與結構進行有效的“指紋”識別。此外，根據物質的特征峰強度信息，還可實現定量分析[1]。

絕大多數目標分析物的本征拉曼信號極其微弱，通常采用的策略為“目標分析物的放大”或“檢測信號的放大”。前者通常針對的目標分析物為DNA，通過多次復制DNA鏈來確保檢測結果的靈敏度，最具代表性的技術為聚合酶鏈式反應(PCR)[2]；后者則是通過物理或化學手段使原有信號顯著增強，最具代表性的技術為表面增強拉曼散射(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)技術。SERS信號的放大主要源于散射光與金屬基底的電磁交互作用，即通過等離子體共振的方式使得拉曼光信號增強[3]。SERS以其高靈敏特性進一步拓寬了拉曼光譜技術在現場快檢領域的應用范圍。當前已開發的SERS分析方法具有速度快、靈敏度高、成本低、儀器輕便、設備操作和前處理簡單等優點，因而此技術非常適用于微痕量物質的現場快速檢測。

根據檢測方式的不同進行劃分，拉曼光譜技術既能對目標物進行直接檢測，又可通過衍生或傳感等方式實現間接檢測。本文按照上述分類方法，系統地綜述了拉曼光譜技術在食品安全、醫藥管理、刑事偵查和環境監測等現場快檢分析領域中的應用現狀；同時對拉曼光譜技術在現場快檢領域中的發展前景進行了分析和展望。

1 拉曼光譜現場快檢技術的研究現狀

對于具有拉曼活性的目標分析物，且在體系中干擾物質較少的情況下，直接檢測是最為簡單有效的方法；若樣品的含量極少或本征拉曼信號極弱時，可通過引入合適的SERS基底，經過較短的作用時間便可采集到高質量的SERS光譜。但此方法用于定量分析時具有一定的局限性，易受到SERS基底制備水平與測試條件控制精度等多方面的影響，導致重現性不佳。當目標分析物不具有拉曼活性或體系中存在其它組分干擾的情況下，通過采取適當的分離富集方式或化學衍生手段(即間接檢測法)，最終實現目標物的特異性識別則顯得尤為重要。現場快檢技術要求樣品前處理方法簡單、省時，最理想的情況是無需樣品處理便可直接檢測，故對分離富集技術提出了較高的要求。另外，以偶氮化衍生法為例，通過對目標物進行重氮化反應，將其轉化為SERS響應較強的物質可實現高靈敏檢測，此法雖拓展了拉曼光譜技術的應用范圍，但需考慮由于殘余衍生試劑競爭吸附所帶來的定量準確性下降等因素，增加了測試難度[4]。

為克服上述難題，SERS傳感技術應運而生。SERS傳感檢測所用的試劑是一種復合材料，通常由修飾了特定信標分子的SERS增強基底和最外層包裹的保護層構成。貴金屬納米粒子作為SERS增強基底，其使得處于“熱點”區域的分子信號大幅增強。信標分子則用作標記物，當受到高強度激光照射時，會向空間中發射拉曼散射光，這部分光信號的光譜分布、強度以及產生的精確位置成為樣品分析時的有用信息。外層保護層則由物理化學性質較穩定的材料(通常是高聚合物)制成，將其包覆在信標分子的外層，以確保SERS傳感器的穩定性、兼容性與可控性等，從而為開發相應的分析方法或檢測裝置奠定了基礎[5]。

目前，這種依靠信標分子的特征譜帶進行精確分析的檢測模式，正越來越多地被應用于快檢分析領域的各類檢測對象，包括重金屬離子、有機小分子、無機陰離子和生物大分子等。該模式靈活多變，大致可分為3類。第一類，分析物引起拉曼信標分子修飾的貴金屬納米粒子在溶液中發生聚集/分散，由于粒子間的等離激元耦合帶來的熱點效應發生相應改變，信標分子的拉曼信號亦會呈現“turn on”或“turn off”模式的改變，以此建立分析物濃度與信標分子特征峰強度的數量關系，實現定量檢測(見圖1A)。這種檢測模式脫胎于“貴金屬納米粒子分散狀態改變引起溶膠體系的等離激元共振吸收改變”而建立的可視化檢測方法，不同之處在于SERS的靈敏度更高，定量結果更準確。第二類則以納米基底表面信標分子與目標物的化學/物理作用為前提，當信標分子的某個拉曼特征峰強度或位移發生改變時，其變量與目標物濃度可建立定量關系從而實現目標物的定量檢測(見圖1B)。與第一類檢測模式相比，第二類模式是從特征峰的強度比值或位移來尋求目標物的定量依據；而第一類模式則根據特征峰的強度來建立定量關系。第三類，與傳統的熒光標記相似，借助SERS納米探針標記，依托拉曼信標分子的高分辨特性實現多個目標物的同時檢測。這種檢測模式與第二類模式的適用體系十分相似，常見于固相基底表/界面的標記檢測，或細胞、生物組織等的標記成像研究(見圖1C)[6-7]。

圖1 基于SERS的3類主要檢測策略Fig.1 Three main strategies based on SERS detection

2 拉曼光譜技術在現場快檢領域中的應用

拉曼光譜可提供待測物質的“指紋”圖譜信息，通過對目標物與標準品的譜圖進行比對，即可準確識別出對應物質是否存在。目前，諸多儀器公司均可提供相應的標準圖譜庫，可實現目標物的自動分析與判定，且能在較短時間內給出測試結果。同時，拉曼光譜特征峰的強度大小則包含了目標物的濃度信息，可通過建立標準曲線、采用外標或內標等方法對目標物進行定量分析。

2.1 食品安全

目前，我國的食品安全事件主要包括違禁添加劑的使用或限用添加劑的濫用，農獸藥殘留以及微生物的污染等。以檢測食品中的違禁添加劑蘇丹染料為例，不法商家為增強產品的色澤，可能在各類食品和藥品中違法添加蘇丹染料。然而，蘇丹染料作為一種脂溶性化合物，分子中含有偶氮苯結構，其重氮鍵可分解為芳香胺，會增加人類患癌的風險。國際癌癥研究機構(International agency for research on cancer,IARC)將蘇丹染料列為第三類致癌物質，并禁止使用蘇丹染料作為食用色素，因此準確檢測食品中的蘇丹染料顯得尤為重要。Lu等[8]利用環糊精的主客體效應“捕獲”蘇丹染料分子，并借助紙基底上負載的貴金屬納米粒子提供“熱點”，從而實現草藥中蘇丹染料的高效定性、定量分析，檢出限可達10-7mol/L。值得一提的是，以蘇丹染料為代表的大多數食品著色劑的SERS響應較強，均可進行類似的直接檢測。此外，拉曼光譜技術也廣泛應用于水稻中敵瘟磷[9]、果蔬皮中倍硫磷[10]、原料奶中噬菌體和抗生素污染物[11]等食品安全現場快檢領域。但上述直接檢測法的定量結果因易受SERS基底與測試條件的影響，其可靠性欠佳。因此，許多研究者致力于高性能SERS基底的制備與新型測試方法的開發等工作[12-19]。Fang等[20]首次設計出便攜式SERS微滴管，采用內標法實現了果蔬表面有機殘留物的微區采樣與多組分的精確定量檢測，可檢測到辣椒和黃瓜皮中的8 nmol/L福美雙、8 nmol/L孔雀石綠和1.5 μmol/L(400 ppb)甲基對硫磷。表1列出了目前在食品安全領域中應用拉曼光譜技術實現檢測的近百種分析物。

表1 拉曼光譜技術在食品安全領域中的應用Table 1 The application of Raman spectroscopy technology in food safety field

圖2 一種對痕量危險品進行快速定性定量分析的專用化SERS基底[66]Fig.2 A miniaturized SERS substrate for qualitative and quantitative detection of trace trinitrotoluene explosive[66]

2.2 刑事偵查

刑偵領域內常規的分析物為顏料、生物殘留、爆炸物、藥物毒品等，其最受關注的問題往往是以上目標物的定性分析，且要求測試方法無損、快速、靈敏。拉曼光譜技術以其獨特的優勢與上述要求完美契合?；诖?，Dmitry等[61]利用SERS快速、非損傷、熒光干擾小等特點，可識別出頭發是否被人工染色，并能確定頭發是否使用了永久性或半永久性著色劑，以及給出相應染發劑的商業信息，從而提供了頭發證據的法醫調查新視角。Kyle等[62]將拉曼光譜與化學計量學相結合，可通過分析血液樣品來區分供血者的年齡。Aron等[63]以SERS直接檢測法，使用手持式拉曼光譜儀實現了環孢素、環三亞甲基三硝胺(RDX)、安非他明和苦味酸的超痕量檢測(可低至fg)。Xu等[64]通過改善SERS基底(Ag納米顆粒)的制備方法，成功檢測了痕量的二硝基茴香醚(DNAN)爆炸物。Roberto等[65]則從專用化儀器開發角度著手，成功研制了一款新型的拉曼光譜裝置，用于檢測人體隨身攜帶的爆炸物，可應用于目標物表面硝酸銨(AN)、2-甲基-1,3,5-三硝基苯(TNT)、季戊四醇四硝酸酯(PETN)和硝酸脲(UN)的精確分析，檢出限可達289 μg/cm2。但對于痕量爆炸物的檢測等特殊情況，僅靠上述示例中簡單的“混合式”SERS直接檢測法很難獲得準確的分析結果，這主要是由于其濃度低、干擾嚴重。此前，He等[66]利用對氨基苯硫醇(PABT)與TNT的復合物具有電子共振活性這一特點，通過在硅片上設計一種專用化的SERS基底(如圖2)，實現了TNT的超高靈敏度檢測，檢出限低至～1 pmol/L(～45.4 fg/cm2)。Wang等[67]則結合高效的預處理步驟，在便攜式拉曼光譜儀上實現了血漿或尿液中微量去極化神經肌肉阻滯劑琥珀膽堿的檢測，在血漿中檢出限達到1 μg/L，在尿液中達到10 μg/L。然而，目前拉曼光譜技術在刑偵快檢領域內仍有很大的應用空間。如文印筆跡等證物的分析往往需要較高的空間分辨率，現階段只有顯微共聚焦拉曼光譜儀才能勝任。諸如此類應用領域，亟需開發相應的小型分析裝置和高效分析方法來實現特殊樣品的快速分析。

2.3 醫藥管理

在藥品中，大多數藥物活性成分(APIs)以固體顆粒形式存在。APIs的含量、分布以及構象的差異將導致藥物具有不同的理化性質，這給制藥行業原材料表征、配方、工序和終端產品質量控制等方面帶來了巨大挑戰。故而在研發、生產和儲運過程中，提供一種用于APIs和輔料的定量分析和固體藥物構象的高效評估方法至關重要。拉曼光譜技術無需制樣，可實現快速、非侵入式檢測，能夠透過塑料包裝、容器壁等透明介質靈活測定樣品。上述特點使得拉曼光譜技術非常適合于各種藥物的實時過程監控，拉曼光譜法現已被中國藥典、美國藥典和歐洲藥典列為法定的藥物分析方法，適用于制藥行業藥物原輔料、中間體、包裝材料入廠進行100%鑒別確認、生產環節中的質量控制，以及藥品防偽檢測等場合。Kathryn等[68]引入主成分分析法(PCA)，使用手持式拉曼光譜儀在短時間內實現了混合藥物中苯佐卡因、利多卡因、異丙腎上腺素和去甲麻黃堿4種APIs的準確識別。此外，Syed等[69]采用SERS技術檢測了合成藥物中痕量大麻素和α-吡咯烷基戊酰苯，檢出限分別達1 pmol/L與10 nmol/L。Lu等[70]結合化學計量學方法，開發了一種用于鑒定藥物真偽的新型識別系統，已通過7種(40批次)降血糖藥片和12種常規藥物輔料進行了基準測試，靈敏度、特異性和準確性指標分別為96.77%、97.48%、96.35%。結果表明，該鑒定系統適用于可疑假藥的現場初步篩查。

2.4 環境監測

環境監測領域中的快檢分析對象主要為無機陰離子、有機小分子、重金屬離子和微生物等。由于實際環境的特殊性與復雜性，對測試方法的選擇性要求較高，因此極大地限制了直接檢測法的應用范圍，其通常需要借助繁瑣的分離富集技術來純化目標物。以水體中常見污染物As(Ⅲ)的SERS檢測為例，不同形貌的SERS基底以及其表面不同的化學環境、Au/Ag納米顆粒的聚集程度、干擾物質的去除效果等均會對定量分析結果的準確性造成影響。為解決這些難題，Qi等[71]借助微流控芯片技術，通過在流體通道內修飾經谷胱甘肽/4-巰基吡啶改性的Ag納米顆粒，成功實現As(Ⅲ)的精確定量分析，方法具有較高的重現性與選擇性。Liu等[72]利用SERS與固相微萃取聯用技術，成功實現了紡織品中三甲基氯化錫、三丁基氯化錫和三苯基錫的現場快速篩查，檢出限分別可達6.9 ppb、1.1 ppb和0.2 ppb。Rafael等[73]將SERS與Sammon's mapping(一種信息可視化技術)結合，可從具有較高背景干擾的水樣中提取出高毒性除草劑阿特拉津的光譜信號，其檢出限約為5×10-12mol/L。

此外，還可通過優化SERS探針的特異性來提高檢測結果的準確性。常見的物質在1 800～2 800 cm-1的拉曼光譜區域(“靜默區”)內一般不會出現特征譜帶，特別是對于生物體系，更是鮮有發生。因此，含—C≡C或—C≡N三鍵的一類信標分子以其特征拉曼譜帶位于光譜“靜默區”而具有無背景干擾、特異性較高的特點，非常適用于復雜體系的分析。基于此，文獻[74]制備了一種新型的三鍵分子編碼的SERS傳感器，并成功用于富含有機污染物的污水中重金屬離子含量的快速檢測，檢出限低至0.77 nmol/L(Hg2+)和0.86 nmol/L(Ag+)。

3 展 望

隨著近年來各行業檢測需求的大幅增長，“快檢”、“快篩”和“實驗室前置”的概念已深入到很多行業，制藥行業已有普及拉曼光譜之勢，食品安全、公共安全、材料檢測領域的拉曼光譜應用也在急速增長。與此同時，政府部門對與環境相關的法律條文做出了修訂，新增近百項污染物的測試項目。這表明市場內仍亟需提供大量高效的快檢技術，故而拉曼光譜技術在這一熱潮中大有可為。此外，目前商品化的便攜式或手持式拉曼光譜儀高度集成化，相比現有的快速檢測設備價格偏高，且應用范圍有限。如：在文物鑒別與保護等特殊的現場快檢領域內，為保護珍貴樣品的原貌，測試過程中所允許使用的激光功率往往比較小，導致當前的小型拉曼光譜儀的靈敏度不能滿足要求。可以預見，隨著新型測試方法的開發與儀器性能的完善，拉曼光譜技術將在現場快檢領域內發揮日益重要的作用。