敦煌地區產胞外多糖菌株的篩選鑒定及其發酵條件研究*

周 璇 牛世全 鄭豆豆 王 彥 朱學泰 孔維寶 張愛梅

（西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070）

微生物胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是指微生物在生長代謝過程中分泌到培養基中的大分子聚合物［1］。近年來，微生物胞外多糖以其生長周期短、安全性高、理化性質獨特等優點廣泛應用于食品、制藥、化工、環保等領域［2-3］。據統計，目前全世界微生物多糖年加工產值可達80 億美元左右［4］。 雖然到目前為止有49屬76種微生物能夠產生胞外多糖［5］，但是真正投入工業化生產的胞外多糖只有黃原膠（xanthan）、結冷膠（gellan）、普魯蘭（pullulan）、熱凝多糖（curdlan）、鼠李膠（rhamsan）等10 余種［6］。 因此，開發具有應用價值的新型微生物胞外多糖是目前世界上亟待解決的問 題［7-8］。

極端環境是潛在的、 重要的微生物資源庫之一。 極端環境下微生物所產生的胞外多糖在多樣性和功能上更具優勢， 已經成為近幾年新的研究熱點［9］。趙惠婭等［10］從600 余株南極微生物中篩選出2 株可產生顯著提高大菱鲆免疫活性的胞外多糖的極地菌株20#3 和3-3-1-2， 為極地胞外多糖作為水產動物飼料添加劑提供一定的基礎資料；龍寒等［11］從廣西北部灣分離得到一株產EPS 的海洋弧菌， 并發現該EPS 對腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用。 鹽堿土壤是極端環境的一種，鹽堿土壤中微生物所產胞外多糖同樣也具有多種優良特性。 艾雪等［12］從柴達木盆地荒漠鹽土中分離出19株耐鹽堿細菌， 并發現其所產胞外多糖對沙漠化防治及改善荒漠生態環境有極大應用價值；高爽等［13］分離得到的一株中度嗜鹽菌Halomonas sp.H09 所產胞外多糖在玉米淀粉加工企業廢水的處理中，添加量少、絮凝熱穩定性較好，具有較高的應用優勢；Juan Antonio Mata 等［14］從西班牙南部Jaén 地區鹽堿土壤中分離得到菌株H. ventosae Al12 T 和Al16 所產胞外多糖具有較強的結合陽離子的能力， 在治理重金屬離子的污染等方面有著深遠的意義；Ruiz-Ruiz 等［15］分離得到的一株嗜鹽菌所產EPS 經硫酸化后具有較強的抗腫瘤活性，為癌癥的治療提供理論依據。

敦煌地區位于河西走廊的最西端， 常年干旱少雨，水分蒸發量較大，土壤鹽堿化嚴重，是一類典型的極端環境。筆者前期研究發現，河西走廊鹽堿土壤中微生物多樣性非常豐富， 存在大量的微生物類群［16］，但目前對于河西走廊產胞外多糖的細菌研究未見報導。 因此河西走廊可作為產具有應用價值的胞外多糖微生物的潛在菌源地， 有待進行進一步探究。 本文對從敦煌地區鹽堿土壤中分離的一株胞外多糖產量較高的菌株進行了篩選及鑒定，同時優化了該菌株的產糖培養基。

1 材料和方法

1.1 菌種分離源 樣品采自敦煌地區鹽堿土壤。

1.2 培養基 菌株初篩用LB 固體培養基， 種子液用LB 液體培養基，菌株復篩用發酵培養基［17］。

1.3 菌株初篩 稱取土樣5 g， 放入已滅菌的裝有45 mL 蒸餾水的三角瓶中，振蕩均勻后稀釋6 個梯度； 取50 μL 10-4、10-5、10-6梯度土壤懸浮液涂布于LB 培養基上，28℃恒溫倒置培養48～72 h；挑取在LB 培養基上能產生大量粘稠物質的單菌落，反復劃線純化后，接種于斜面培養基中于4℃冰箱中保存。

1.4 菌株復 篩［18-20］

1.4.1 苯酚硫酸法標準曲線的測定［20］稱取10 mg葡萄糖于100 mL 容量瓶中配制成100 μg／mL 的葡萄糖溶液。 分別取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL 配制好的葡萄糖溶液于潔凈干燥的試管中，加蒸餾水補至2.0 mL，配制成不同濃度的葡萄糖溶液。 在不同濃度的葡萄糖溶液中分別加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL 濃硫酸，靜置10 min 后振蕩搖勻，室溫靜置20 min 后，測定其在490 nm 處的吸光值。 取2.0 mL 蒸餾水作為空白對照。 以490 nm 處吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并求出回歸方程。 通過苯酚硫酸法確定了總糖含量的標準曲線如圖1所示，標準曲線的回歸方程為y=0.01115x+0.23192，R2=0.9974。

1.4.2 粗多糖的分離 將初篩得到的菌株接種到含有50 mL LB 液體培養基的250 mL 三角瓶中，28℃、160 r／min 培養24 h 制成種子液。 將發酵好的種子液以5%（v/v） 的接種量接種于裝有50 mL發酵培養基的250 mL 三角瓶中， 培養48 h 后將發酵液煮沸滅活，10 000 r／min 離心10 min，取10 mL 上清液，加入3 倍體積95 %乙醇，用力振蕩至產生絮狀沉淀后，4 ℃沉淀過夜。 再經過10 000 r／min 離心10 min 后棄上清液，所得沉淀烘干，加入少量蒸餾水溶解，定容至10 mL。 以葡萄糖為標準品，制作標準曲線，用苯酚硫酸法測定多糖含量， 選取胞外多糖產量最高的菌株作為目標菌株。

1.4.3 多糖含量測定［20］將按照1.4.2 操作所得的粗多糖溶液稀釋10 倍，取2 mL 稀釋后的多糖溶液于試管中， 分別加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL 濃硫酸，靜置10 min 后振蕩搖勻，室溫靜置20 min，測定其在490 nm 處的吸光值，并參照回歸方程求出總糖含量。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 生理生化測定及形態學鑒定 將目標菌株劃線接種于LB 培養基上，28℃恒溫倒置培養24 h，觀察菌落形態特點，通過革蘭氏染色和芽孢染色對菌體形態進行觀察，并參考東秀珠等［21］的方法進行生理生化鑒定。

1.5.2 16S rDNA 分子生物學鑒定及系統發育樹的構建 采用細菌基因組DNA 提取試劑盒（Omega bio-tek，America）提取細菌DNA，以27F和1492R 為引物進行PCR 擴增。 反應體系如下：12.5 μL 2×Taq mix，7.5 μL 去離子水，4 μL 模板DNA，引物各1 μL，總體積25 μL。PCR 反應體系組成為：95℃預變性3 min，95℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，30 個循環；72℃終延伸5 min。

產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，陽性PCR產物經純化后送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。 所得序列與NCBI 數據庫比對，采用MEGA 4.0 繪制系統進化樹。

1.6 最佳培養基優化

1.6.1 粗多糖分離與多糖含量測定 將粗多糖溶液稀釋100 倍后用苯酚硫酸法測定多糖含量，粗多糖的分離與多糖含量測定同1.4。

1.6.2 單因素實驗 為提高產糖量，通過設計單因素實驗，28℃160 r／min 振蕩培養48 h 后測定產糖量，選擇發酵因子中的最佳水平。

1.6.3 正交設計實驗 在單因素實驗結果的基礎上，設計4 因素3 水平的正交實驗（表1）。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選 從敦煌地區鹽堿土壤中初篩共得到的18 株產多糖的菌株， 經編號并通過苯酚硫酸法測定多糖含量，結果表明，菌株Ⅱ4-01 胞外多糖產量最高，達到0.846 g／L。 選取菌株Ⅱ4-01 作為目標菌株。初篩所得18 株菌株胞外多糖產量如表2 所示。

表2 18 株菌株的胞外多糖產量

2.2 菌株鑒定 菌株Ⅱ4-01 在LB 培養基上培養24 h 后， 呈現白色不透明的單菌落， 表面粗糙皺褶，邊緣不整齊，菌落直徑約為3 mm。 革蘭氏染色后呈陽性，芽孢染色后呈橢圓形，芽孢中生。 菌株Ⅱ4-01 可水解淀粉和纖維素，可利用檸檬酸鹽，可分解色氨酸形成吲哚， 能分解葡萄糖產生乙酰甲基甲醇；對碳源的利用結果表明，菌株Ⅱ4-01 能利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、甘油，不能利用精氨酸（表3）。

表3 菌株Ⅱ4-01 的生理生化特征

經PCR 對16S rDNA 擴增得到片段長度約為1 450 bp 左右的序列， 測序后與NCBI 數據庫進行Blast 比對。 結合菌株Ⅱ4-01 的形態學特征和生理生化鑒定結果，進一步證明菌株Ⅱ4-01 為一株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

2.3 單因素實驗

2.3.1 不同碳源對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響碳源是提供微生物營養所需碳元素的營養來源。除水分外，微生物需要量最大的營養物為碳源，碳源也決定微生物所產多糖的質量和數量［22］。對不同碳源的利用實驗結果表明， 菌株Ⅱ4-01 對6 種碳源均可利用，不同碳源條件下胞外多糖產量為：蔗糖＞淀粉＞葡萄糖≈玉米粉＞麥芽糖＞甘油，以蔗糖為發酵培養基碳源時菌株Ⅱ4-01 的胞外多糖產量高達4.218 g／L（圖2），因此確定蔗糖為最佳碳源。

2.3.2 不同氮源對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響

氮源能提供微生物生長所必須的核苷酸、維生素合成所需的營養物質。 不同氮源對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響如圖2 所示，菌株Ⅱ4-01 對黃豆粉的利用能力明顯高于其他氮源， 因此選擇黃豆粉為最佳氮源。

2.3.3 不同無機鹽對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響 無機鹽是維持微生物生長代謝不可或缺的物質，其功能主要是參與菌體的構成、作為酶的組成部分、調節滲透壓等［19］。 由圖2 可知，向培養基中添加相同濃度的KCl、NaCl、MnCl2、CaCl2時， 菌株Ⅱ4-01 的EPS 產量并沒有明顯波動，而添加MgSO4時菌株Ⅱ4-01 EPS 產量明顯高于添加其他4 種無機鹽的產量。

2.3.4 蔗糖濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響碳源濃度對多糖產量影響較大，碳源濃度適宜時，菌株才能正常生長并產生大量代謝產物［12］。 將蔗糖濃度設置為1%、2%、3%、4%，探究碳源濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響，結果如圖3a 所示，隨著蔗糖濃度的增加，EPS 產量逐漸升高，濃度為2%時增加明顯。 考慮到經濟因素，加之碳源濃度從2%～4%時，EPS 產量并未顯著增加， 因此確定最佳蔗糖濃度為2%。

2.3.5 黃豆粉濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響 氮源濃度對EPS 產量的影響如圖3a 所示。隨著氮源濃度增加，菌株Ⅱ4-01 EPS 產量呈現先升高后降低的趨勢， 當氮源濃度為2%時，EPS 產量最高，達到4.801 g／L。

2.3.6 MgSO4濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響將MgSO4濃度設置0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07% 5 個梯度。 由圖3b 可知，隨著MgSO4濃度的增加，EPS 產量先升高后降低，當MgSO4濃度為0.05%時，EPS 產量達到5.359 g／L。

2.3.7 培養基pH 對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的影響 pH 對微生物生長和代謝途徑都有很大影響。將上述優化發酵培養基的初始pH 調整為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，pH 對 菌 株Ⅱ4-01 EPS 產 量 的影響如圖4 所示。 當培養基中初始pH 在5.0～8.0時， 菌株Ⅱ4-01 EPS 產量逐漸增加，pH 為8.0時，產糖量達到最大，為5.56 g／L。 當pH 超過8.0以后，產糖量逐漸下降。

2.4 正交實驗 以單因素實驗為基礎， 設計4 個因素3 個水平，采用L9（34）進行正交實驗（表4）。由極差分析可知， 對EPS 產量影響最大的因素排序為：碳源濃度（A）＞pH（D）＞無機鹽濃度（C）＞氮源濃度（B），因此，在培養條件相同的情況下，碳源濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產量的貢獻最大。 由表4 可知， 菌株Ⅱ4-01 EPS 產量最高的最佳培養基組合為：A3B3C2D1，即最佳培養基配方為蔗糖25.0 g／L，黃 豆 粉25.0 g／L，MgSO40.5 g／L，Na2HPO4·12H2O 2 g／L，NaH2PO4·2H2O 1 g／L，pH=7.5。

表4 正交實驗結果

2.5 生長曲線分析 經優化后的發酵培養基進行搖瓶發酵，每隔12 h 取1 次樣，測定EPS 產量和生物量。結果如圖5 所示，菌株Ⅱ4-01 在24 h 前為對數期，24 h 后為穩定期，生物量在36 h 達到最大，此時菌株EPS 產量也達到最大，為8.594 g／L。36 h 后，菌株Ⅱ4-01 進入衰亡期，生物量和EPS 產量也逐漸下降。 由圖中曲線可知，菌株Ⅱ4-01 生物量和EPS 產量基本上成正比。因此，選擇36 h 為菌株Ⅱ4-01 多糖的最佳收取時間。

3 討論

由于極端環境的微生物具有特殊的生理機能、基因類型和代謝產物，蘊藏著極大的科學和應用價值，因此成為生物學研究的熱點之一［23］。從海洋、南極等地獲得的胞外多糖樣品是目前對極端環境下胞外多糖研究炙手可熱的方向之一。 從海洋、南極等地分離得到的胞外多糖樣品將有可能成為人類治療腫瘤、心血管疾病等的重要藥用資源［24］。 但是目前對鹽堿土壤下的微生物胞外多糖的研究報導較少，F. Moshabaki Isfahani 等［25］在高鹽環境下分離得到3 株產EPS 菌株B. aerus ATHM35，A.luteolus ATHM36 和H. eurihalina ATHM 37，其中H.eurihalina ATHM 37 產糖量最高，為0.277 g／L；Juan Antonio Mata 等［14］從西班牙南部Jaén 地區鹽堿土壤中分離得到菌株H. ventosae Al12 T 和Al16，在最佳培養條件下， 其產糖量分別為0.2835 g／L和0.2895 g／L， 此外還從西班牙馬拉加省的內陸濕地Fuente de Piedra 鹽堿土壤中分離得到菌株H.anticariensis FP35T 和FP36，其在最優條件下其產糖量分別為0.4360 g／L 和0.5095 g／L；Amjres等［26］分離得到的一株嗜鹽菌在最佳培養條件下產糖量為3.89 g／L。 與上述研究相比，菌株Ⅱ4-01EPS在產量方面優勢明顯，開發和應用研究價值突出。

芽孢桿菌屬菌株能產生多種EPS，例如，果聚糖、β-1，3-葡聚糖和主要由中性糖組成的雜聚物， 以及糖醛酸或糖蛋白結合物等。 相關研究表明，一些分離自芽孢桿菌的EPS 顯示出優異的乳化、絮凝、重金屬去除能力或藥物活性［27］。 王正榮等［28］從沙漠結皮中分離得到的一株芽孢桿菌所產胞外多糖具有較強的絮凝活性；袁建鋒等［29］篩選得到的一株芽孢桿菌所產胞外多糖在體外抗氧化實驗中顯示出較強的抗氧化性， 并且對脂質過氧化有抑制作用， 是一種優良的天然抗氧化劑；Ruiz-Bravo A 等［30］研究結果表明，實驗室分離得到的一株芽孢桿菌所產胞外多糖具有免疫調節特性，能在體外誘導淋巴細胞增殖。 但是，目前對于地衣芽孢桿菌的研究主要集中在微生態制劑［31］或益菌素的生產［32］，對胞外多糖的研究相對較少。 彭愛銘等［33］研究了1 株產EPS 的地衣芽孢桿菌TS-01 的發酵培養基和培養條件，發現該菌株在最優條件下產糖量為3.65 mg/mL，本實驗室分離得到的菌株Ⅱ4-01 在最佳培養基中，即在蔗糖25.0 g／L， 黃豆粉25.0 g／L、MgSO40.5 g／L、Na2HPO4·12H2O 2 g/L、NaH2PO4·2H2O 1 g／L、pH＝7.5的培養基中發酵培養36 h 后，產糖量為8.594 g/L，明顯優于菌株TS-01。此外，彭愛銘等［33］發現菌株TS-01 所產EPS 在一定濃度下清除自由基能力顯著， 同時能增強T、B 淋巴細胞的增殖， 結合Chunhui Liu 等［27］從中國濟南附近某果園土樣中分離得到的地衣芽孢桿菌8-37-0-1 的胞外多糖能顯著刺激脾淋巴細胞的增殖這一研究結果，本研究分離得到的菌株Ⅱ4-01 所產EPS 是否具有同樣的免疫學活性值得深究。

與此同時這些研究也表明， 現有對鹽堿環境下產糖微生物的研究主要集中在產EPS 菌株的篩選、EPS 的提取等方面，對于鹽堿環境下分離得到的EPS 是否具有重要的生物功能和藥用價值還需進一步研究和開發。 另外還有一些研究表明細菌EPS 能結合鈉離子并降低其在土壤中的毒性［34］，因此，敦煌地區分離得到的細菌EPS 能否改善土壤鹽堿化程度也值得進行深入研究。